2016年3月26日

自製顯微鏡的萊茵貝格多色濾鏡、暗視野濾鏡、斜射濾鏡(Rheinberg, Darkfield and Oblique)

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這篇的實作來自這本《Your Microscope Hobby: How To Make Multi-colored Filters: Rheinberg, Polarizing, Darkfield and Oblique》,介紹如何自己製作顯微鏡的濾鏡。

先直接看效果吧,我製作了不同濾鏡,然後拍攝百合花粉的顯微照,都是同樣的標本。
花粉02








若是想要對顯微鏡下的影像增強對比、增強辨識度,我們在國中就學到了,可以使用化學染色的方式。但是化學染色操作上有些困難,有些染劑具有毒性對人體有危險性,而且會殺死目標生物,所以若是想觀測活細胞,就不能用化學染色(除非能使用不殺死細胞的染色方式)。

要增強對比還有其他方式,像是使用相位差(phase contrast)、暗視野(暗場,dark field)、斜射照明(Oblique Light)、微分干涉顯微鏡(differential interference-contrast microscopy)。

或是本篇介紹的光學染色(Optical Staining),使用萊茵貝格濾鏡(Rheinberg filter)。而只要會製作萊茵貝格濾鏡,更可以延伸製作出可變偏光Variable Darkfield(使用單片偏光片)以及Polarized Rheinberg(中央擋板為彩色片,外環為偏光片)。







萊茵貝格濾鏡的使用限制

萊茵貝格濾鏡易於製作、操作,價格也很便宜,但是使用上受限於顯微鏡的類型。首先必須要有聚光器。

最早的聚光器,要算是虎克的那個有名顯微鏡,裝了水的透明圓球和一個平凸透鏡,構成了聚光器。






我們顯微鏡的聚光器,是這類型的搖出式濾鏡放置座的阿貝式聚光器,聚光器可以把底部的鹵素燈光源聚光成光錐,投射到標本上。

IMAG1152
IMAG1151
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我們學校十多年前買的學生用顯微鏡還有這個結構,但是最近採購的顯微鏡都已經沒有這個東西了,特別是新近使用LED作為光源的顯微鏡,也沒有這個聚光器了。


能使用萊茵貝格濾鏡的聚光器,像是一般的阿貝氏聚光器(Abbe condenser)或是消色差聚光器(achromatic condenser)都可以,而平場聚光器(plan condenser)沒辦法使用。NA值越大的聚光器會比較好(例如1.9NA會比1.4NA好)


萊茵貝格濾鏡一般適用的物鏡是20x以下的消色差物鏡,像是10x、4x的物鏡。若是要使用在更高倍的物鏡上,則需要精密測量才能製作,因為高倍物鏡的鏡頭更小了。

物鏡的部份,如果是使用Neofluor、plan-apo或是phase contrast的物鏡,結果可能比一般消色差物鏡要差。




萊茵貝格濾鏡製作所需的材料與工具

了解使用限制之後,來看看材料和工具。萊茵貝格濾鏡包括二個部份,一個是中央擋板(center stop),第二是外環(annuel)。中央擋板提供背景色,而外環則是提供照射物體所需的光源,需要透明度較高的材質。關於萊茵貝格濾鏡的光路圖,可以看以下的網站,有很清楚的說明
https://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/rheinberg.html



製作濾鏡的基本工具是圓規刀、切圓器、護貝機、護貝膠膜、游標尺
畫圓
畫圓025
畫圓03


材料則是黑紙、絕緣膠帶、玻璃紙,或是任何你想到的有色透明材料都可以試試看。
IMAG1147


黑紙是用來製作暗視野濾鏡,以及提供後來製作萊茵貝格濾鏡的口徑參考。
IMAG1148


製作流程

1.先用游標尺量聚光器上的濾鏡座尺寸內徑,一般顯微鏡都是32mm左右,高級一些的顯微鏡可能會用到35mm或是42mm、45mm。

2.用割圓器切割出直徑15~30mm的圓形黑紙片,然後把它們都護貝起來,再用割圓器切割成直徑32mm的圓。(這步驟請不要使用圓規刀,因為會造成中間有洞)
濾鏡02


3.使用矽藻、花粉、棉纖維、蝴蝶翅膀等標本來作顯微鏡觀察。

4.先進行一般明視野的觀察,但是僅使用4x物鏡,不加任何濾鏡、光圈開到最大、聚光器抬到最高,看清楚之後,不作任何調整,直接進行下一步。

5.在聚光器的濾鏡座放入前面製作的黑圓片。測試不同尺寸的濾光片,看看用到哪個直徑的中央擋板可以達到背景全黑。(一般適用的直徑為15-18mm,但適用我顯微鏡的尺寸是22mm)

6.接著再換10x物鏡來測試一次,有些顯微鏡在4x和10x物鏡(0.25 NA)可以用同一尺寸的中央擋板濾鏡,如果你的沒辦法,那就要不同倍率物鏡就作不同直徑的濾鏡。



這是明視野下花粉的樣子
00_Normal


成功的暗視野觀察會像是這樣,具有黑色的背景,而標本還是能清楚看到。
  00_DarkBackgroup


萊茵貝格多色濾鏡的製作過程

你可以把萊茵貝格濾鏡的外環和中央擋板分開製作,這樣能夠任意組合想要的效果,或是結合暗視野、斜射照明的濾鏡。當然你也以直接將外環和中央擋板組合在一起,不過這樣就缺少很多自由。

中央擋板透明度可以低一些,提供明度較低的背景,而外環的透明度就要高一些。建議可以用絕緣膠帶來作中央擋板,如果膠帶不夠寬,可以將兩三條膠帶貼在一起,這樣就變寬了。外環則是用玻璃紙來製作,當然你反過來製作也可以。

製作中央擋板的部份要注意不要使用圓規刀,如果只能用圓規刀,就要小心不要讓中央有洞。單純製作外環的話則是沒關係,反正中間的部份會被挖掉。而如果想要把切下來的圓形當作中央擋板那就要注意了(這是無限迴圈嗎)


下圖最左行是利用偏光片製作的,可以讓標本有不同的背景。第二直行是直接把外環和中央擋板作在一起,其他則都是外環和中央擋板分開製作的濾鏡。
濾鏡03



藍色中央擋板,適用在黃色標本,讓對比明顯
00_BlueCenterStop

藍色中央擋板,再加上紅色外環,可以讓標本顏色偏紅
00_BlueCenterStopWithRedRing02


你也可以做出多色濾鏡
濾鏡04


使用綠色黃色的中央擋板
00_greenYellowCenterStop

使用多色的中央擋板(紅綠藍黃),會在背景產生多種顏色漸層的效果
00_4colorCenterStop


多色濾鏡的製作方式,是把玻璃紙(濾色片)先排好放在護貝膠膜裡護貝,然後切割出中央擋板和外環,再把切下來的東西再護貝一次,切割下來。
濾鏡06



而利用黑紙,也可以製作出不同斜射照明濾鏡,效果類似微分干涉顯微鏡,能讓標本具有立體感。
濾鏡01


這是利用月形的斜射照明濾鏡(第四行第四個),有特別的立體感
00_newMoon00


月形的濾鏡加上藍色中央擋板,提供立體感外,再加上暗藍色背景
00_newMoonWithBlueCenterStop


收納的方式則是用圓盒子裝起,就可以任意組合使用了。
濾鏡05



以下則是不同的樣本照,最左和最右是用不同的藍色中央擋板,中央則是未經過白平衡,也沒有加濾鏡。

花粉03




不同濾鏡下的花粉
花粉



完全透明的口腔皮膜細胞,使用不同濾鏡也可以看清楚不同的細節。
口腔皮膜細胞

這也有另外一種作法,是用印表機印出濾片的
http://www.quekett.org/resources/rheinberg

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