2016年3月6日

ImageJ進行吸光值、透光率、透光度與OD值計算的公式與應用

透光度、透光率的計算


「入射光」是穿透介質之前的光
「透射光」是穿透介質之後的光
把透射光的強度除以入射光的強度,就可以計算出透光度 transmittance

t=透射光強度/入射光強度

如果要轉換成透光率(percent transmittance ,T%),就再把透光度x100%,就是透光率。



舉例來說,若是經由儀器測量一道光照射一杯溶液之前的入射光強是50單位,通過溶液之後的透射光強是20單位,那麼溶液的透光度就是20/50=0.4,透光率可以說是40%。當然,如果溶液可以讓光完全通過,那麼透光率就是100%

吸光值的計算

接下來說到吸光值,這牽涉到溶液的許多性質,像是光通過溶液所走的光徑和溶液的濃度。可想而知的是,光徑越長,被吸收的光就會越多。

可以想一個壞蛋搶劫的故事,如果有一個壞蛋會搶走你身上50%的錢,那麼你帶著100元先後經過兩個壞蛋,你留下錢會是多少?不是0元,而是25元。你有一百元,第一個壞蛋會搶走你50%的錢,所以你剩下50元,而第二個壞蛋再搶走你50%的錢,所以他拿走25元,因此你會剩下25元。

光通過溶液之後,衰減的光亮就類似這種情形。經過越長的光徑,吸收的光就會越多。


Lambert' Law的重點是光的吸收程度和溶液的厚度(光走的路徑長)有關,Beer's Law 光的吸收程度和濃度有關。結合兩個定律,成為比爾-朗伯定律(Beer–Lambert law),吸光值可以表示為

A=K*l*c
(吸光值=吸收係數*吸收介質的厚度*吸光介質的濃度)
(absorbance也翻譯成吸光度、吸光值,簡寫為A。)
具體的推導過程可以看wikipedia



依據Beer–Lambert law的公式,只要測量出透射光和入射光強度,就能計算出吸光值
A=-log10(透射光強度/入射光強度)


OD值與透光度、透光率的換算表


吸光值有些情況也會用OD(Optical Density,光學濃度、光學密度、光密度)來表示。
光學濃度(OD) 衰減率 透光率(percent transmittance,T%) 透光度(transmittnace,t)
0 0 100% 1
1 1/10 10% 0.1
2 1/100 1% 0.01
3 1/1000 0.1% 0.001
4 1/10000 0.01% 0.0001
5 1/100000 0.001% 0.00001
6 1/1000000 0.0001% 0.000001


從OD值推算透光度的方式,舉例來說

OD=0.05,透光度就是10^(-0.05)=0.891,透光率是89.1%
OD=0.5,透光度就是10^(-0.5)=0.3162,透光率是31.62%
OD=1,透光度就是10^(-1)=0.1,透光率是10%
OD=2,透光度就是10^(-2)=0.01,透光率是1%



由於在同樣的光徑長度下,吸光值和溶液濃度成正比,所以要定量出溶液的相對濃度時,經常會用OD值來表示。例如在西方轉漬法中,需要偵測蛋白質的呈色強度,藉以判斷蛋白值的濃度。

使用OD值來表達待測物的濃度時,要注意樣品是怎麼拍攝的,必須是透射拍攝,比如拍攝電泳凝膠的情況。光源和影像擷取裝置分別在凝膠的兩側,影像擷取裝置拍攝的是通過凝膠的光。

家用的平台掃描器掃描出來的影像不能用OD值的運算方式,因為一般平台掃描器的影像拍攝方式是反射拍攝。影像擷取裝置拍攝的是物體的反射光。

校正的OD值

要想知道實驗結果的OD值,一種方式是將標準的參考物一起掃描,再用那個參考物來校正。標準的參考物如Stouffer 21-Step Transparent Guide(21級曝光尺、光密度尺),這是一條長形的透明片,上頭印了21階的灰階,每塊色階都有標準的OD值。

以下以STOUFFER的21級曝光尺(淘寶連結)為例,依據此文件《Riston and Stouffer Density Tablets》的表格,各級的OD值,從1到21依序為
0.05
0.20
0.35
0.50
0.65
0.80
0.95
1.10
1.25
1.40
1.55
1.70
1.85
2.00
2.15
2.30
2.45
2.60
2.75
2.90
3.05

在測量一個待測物的OD值時,可以連同此曝光尺一起進行透射掃描,得到影像後,用ImageJ量測影像中此曝光尺的灰階值,再用灰階值與標準OD值進行校正,即可得到待測物的OD值為何了。

校正的功能在Analyze/Calibrate ,function選擇"Rodbard",執行步驟可見ImageJ的範例文件《Optical Density Calibration》。這是利用灰階值和標準OD值這兩組數據,計算出一條校正曲線與公式,將影像中的灰階值套入公式,得到校正後的OD值(Calibrated OD)

未校正的OD值計算(uncalibrated OD)

如果透射掃描時沒有附上校正用的曝光尺,則只能使用現有影像進行校正得到未校正的OD值(uncalibrated OD)。功能一樣在Analyze/Calibrate ,但unction選擇"Uncalibrated OD"

Uncalibrated OD的計算公式為  OD =- log10(Pixel value 255)

這是假設影像中灰階值為255的部份,是光線完全透射的。因此設定入射光強為255,而像素的灰階值就相當於透射光強。這個功能只能在8-bit影像中進行,若要對彩色影像進行Uncalibrated OD計算,就要將之轉為8-bit影像。

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