想像一個細胞是一棟透天厝，顯微攝影是從高空往下拍，因為淺景深，所以往往是三樓清楚、而一二樓模糊，或者是二樓清楚、一三樓模糊。
景深和數值孔徑的關係密切，計算公式可以從這篇論文(以全對焦影像合成技術修正失焦顯微鏡影像
)找到。
數值孔徑越小，放大倍率較大，景深數值較深
以10倍物鏡來說，數值孔徑是0.25，景深是8.5um
換到40倍物鏡，數值孔徑是0.65，景深只剩下1um
克服景深的問題，在軟體方面，有很多專業的顯微量測影像處理軟體都可以處理，不過那些是收費軟體。屬於開放原始碼的ImageJ當然也有這樣的能力來處理。
處理的流程如下
- 攝影
- 安裝ImageJ的Plugin
- 使用Plugin做影像對齊校正
- 使用Plugin做全對焦合成
下方的四張圖拍攝位置都不變，但改變的是對焦的地方，因為使用微距攝影，所以景深淺，每張照片都只有一部分是清楚的。拍攝時要注意相機位置、構圖不可改變，另外曝光量也不可以改變，數位相機有AE Lock的功能可以鎖定曝光值(我在拍攝這四張樣本的時候，忘記鎖曝光值，所以看起來曝光不一樣)
再來是安裝Plugins，這裡需要三個Plugins，分別是TurboReg、StackReg、Stack Focuser
前面二個是作影像自動對齊的，雖然我們固定了相機位置和構圖，但是實際拍攝的相片還是會有些微的差距，所以需要另外做自動對齊。
而最後一個Plugins是用來做產生合成圖的。
TurboReg、StackReg下載以後解壓縮直接放在plugins的資料夾即可，Stack Focuser 可以放在plugins的Stacks資料夾中。
首先開啟拍攝的四張不同焦點的照片
File-->Open
將多個影像合成一個Stack
Images-->Stacks-->Convert Images to Stack
使用stackreg自動對齊影像
Plugins-->stackreg-->Stackreg
使用Stack Focuser合成為全對焦的影像
Plugins-->Stacks-->Stack Focuser
結果如下，看起來有點醜喔？那是因為我失焦的地方太模糊了，所以才會變成這樣，再加上我一開始拍攝的時候沒有鎖定曝光值。
接下來以顯微照片實際示範，以下是拍攝彩葉草葉脈處的導管(像彈簧的東西)，三張的焦點都不同。我也沒有事先做白平衡，打算最後再用影像處理軟體處理。
然後我把三張合成為一個Stack之後，用Stackreg作自動對齊，順便做剪裁，只留下中間我需要的部位。影像如果太大，那些Plugin處理會弄很久。
最後用Stack Focuser生出的影像，原本失焦的地方不再模糊。
最後用Gimp開啟影像作自動白平衡
圖層-->色彩-->白動-->白平衡
