以imagej的macro實作GUI，進行重疊細胞的分割

上週五收到一個生技公司人員的來信，信中問到要作細胞的分割來計數，但是作分水嶺分割時出現問題。我寫imagej作細胞分割的文章其實寫了好幾篇，本來想說請他看看之前文章就好。不過因為給的圖片很漂亮，剛好議題又是我感興趣的，所以就試試看來解決了。

來看一下圖片。這是利用不同劑量的藥劑處理非癌化細胞後，再以螢光染劑進行染色。研究者的目的是要計算這有多少細胞。


由於有些細胞是重疊的，一般想法就是直接作分水嶺切割，然後再作analyze particles。不過這樣的作法會有大問題。


這是我們期待看到的，兩個細胞被分水嶺算法剛好切開。



但實際上會發生的是，單獨一個細胞往往會被切成好幾塊



或是兩個細胞被切成三塊

如何解決這樣的問題呢？

解決流程是這樣的

(1)先把單獨未重疊的單顆細胞抓出，並計數。

(2)只針對重疊的細胞作分水嶺切割，然後作計數。

現在問題來了，怎麼知道誰是單顆細胞，這裡會運用一個形態學的運算方式來幫助判斷。
以下兩張圖是先將圖片做threshold處理後，轉二值化影像，再用wand tool選取後，然後用Edit/Selection/Convex hull做出的新選取區。

convex hull是個重點！它就像是用條橡皮筋套住你的選取區，產生的新選取區就是convex hull。你看第一張圖片，是兩個細胞重疊，用convex圈起之後，會留下很多沒圈到的地方。第二張圖片是單獨的細胞，圈起來之後留下的空白很少。

所以啊，我們可以用convex hull和細胞的面積做運算，看看細胞在hull裡頭佔面積的多寡來推論那是不是單獨的細胞。

要計算這個東西，其實不用自己手動一個一個圈細胞。在measure中的測量值solidity就是這個啦。你可以勾選Analyze/Set Measurements/Shape descriptors，就可以呈現出這個數值了。

接下來的分析和製作Macro，我就交給影片說明了

影片中所使用的Macro 就是以下的文字啦

=============================================
Dialog.create("Preference");
Dialog.addNumber("solidity:", 0.88);
Dialog.addNumber("cell area min :", 2000);
Dialog.addCheckbox("Single cell fill color", true);
Dialog.addCheckbox("Watershed cell fill color", true);
Dialog.show();
solidityValue = Dialog.getNumber();
cellAreaMin = Dialog.getNumber();
singleCheck = Dialog.getCheckbox();
watershedCheck = Dialog.getCheckbox();

//關閉所有圖檔
run("Close All");
//製作結果表
Table.create("cellCounts");

//打開資料夾，取得檔案list
dir = getDirectory("Choose a Directory ");
list = getFileList(dir);
filecount = 1;
listFiles(dir);

function listFiles(dir) {

for (i=0; i<list.length; i++) {
if (endsWith(list[i], "/")){}

// listFiles(""+dir+list[i]);
else{
//print((filecount++) + ": " + dir + list[i]);
open(dir + list[i] );
bname=File.nameWithoutExtension;
cellCounts();
}
}
}

function cellCounts(){
//細胞有幾個
cellNum_single=0;     //一個單獨的細胞
cellNum_overlap=0;     //重疊的細胞團
  cellNum_watershed=0;  //分水嶺切割後，單獨的細胞

rename("original");

//製作空白的檔案
run("Duplicate...", "title=cell_single");
run("Select All");
setBackgroundColor(255, 255, 255);
run("Clear", "slice");
run("Duplicate...", "title=cell_overlap");
run("Duplicate...", "title=cell_watershed");

//分析前處理
selectWindow("original");
run("Duplicate...", "title=a");
run("8-bit");
setAutoThreshold("Default dark");
run("Convert to Mask");

//把所有細胞都抓出，設定measure參數
run("Set Measurements...", "area perimeter shape redirect=None decimal=3");
run("Analyze Particles...", "size="+cellAreaMin+"-Infinity circularity=0.10-1.00 display exclude clear include add");

//用Solidity推斷細胞是否有重疊
numROIs = roiManager("count");
for(i=0; i<numROIs;i++) {// loop through ROIs
solidity = getResult("Solidity", i);

if(solidity>solidityValue){//Solidity大於0.88者，應該是單顆細胞
cellNum_single =cellNum_single +1;
//塗色
if (singleCheck){
selectWindow("cell_single");
roiManager("Select", i);
setForegroundColor(255*random, 255*random,255*random); //隨機填入顏色
run("Fill");
}
}

else {//如果是小於0.88，可能是多個細胞重疊，進入迴圈作分水嶺切割
cellNum_overlap =cellNum_overlap +1;
selectWindow("cell_overlap");
roiManager("Select", i);
setForegroundColor(0,0,0); //填入黑色
run("Fill");

}
}

//到cell_overlap的圖片中，執行分水嶺算法
selectWindow("cell_overlap");
run("Make Binary");
run("Watershed");
run("Select All");
run("Analyze Particles...", "size="+cellAreaMin+"-Infinity circularity=0.10-1.00 display exclude clear include add");
numROIs = roiManager("count");
for(i=0; i<numROIs;i++) {// loop through ROIs
cellNum_watershed =cellNum_watershed +1;
if(watershedCheck){
selectWindow("cell_watershed");
roiManager("Select", i);
setForegroundColor(255*random, 255*random,255*random); //隨機填入顏色
run("Fill");
}
}

//輸出細胞的計數結果
rowsize = Table.size("cellCounts");
Table.set("filename", rowsize, bname,"cellCounts");
Table.set("cell_single",rowsize, cellNum_single,"cellCounts");
Table.set("cell_overlap",rowsize, cellNum_overlap,"cellCounts");
Table.set("cell_watershed",rowsize, cellNum_watershed,"cellCounts");
Table.update("cellCounts");

//關閉圖檔
selectWindow("cell_single");
saveAs("Jpeg", dir+"1/" + bname+"_1_single"+".Jpg");
selectWindow("cell_overlap");
saveAs("Jpeg", dir+"1/" + bname+"_2_overlap"+".Jpg");
selectWindow("cell_watershed");
saveAs("Jpeg", dir+"1/" + bname+"_3_watershed"+".Jpg");


close("cell_single");
close("cell_overlap");
close("cell_watershed");
close("a");
close("original");
close("Results");
close("ROI Manager");
}