source，會連到github。 github為deepwiki，則可以直接在 DeepWiki 上查看程式碼，並使用 AI 工具進行分析與提問。如果此程式庫尚未被deepwiki收錄，可以輸入email addresss後，deepwiki會自動indexing並通知你。
ImageJ使用一種簡單的內建腳本語言，稱為 ImageJ Macro Language。
ImageJ提供了一個方便的巨集錄製器，可以將手動操作轉換為巨集程式碼。
在ImageJ中錄製巨集：
Plugins > Macros > Record...。Create 按鈕，將記錄的程式碼輸出到一個新的巨集編輯器窗口。Close 停止錄製。ImageJ Macro Language 的語法類似於C語言或其他腳本語言，但更簡化。
- 變數無需顯式宣告類型，直接賦值即可。
- 常見的運算子（+、-、*、/、=、>、<、==、!= 等）皆可使用。
- 條件判斷使用 if 和 if...else 結構。
- 迴圈結構包括 for 和 while。
// ==== 1. 數值類型與變數 ====
var number = 123;
var decimal = 3.14;
var text = "Hello ImageJ";
var array = newArray(1, 2, 3, 4, 5);
print("Number: " + number);
print("Decimal: " + decimal);
print("Text: " + text);
// 列印陣列
print("Array elements:");
for (i = 0; i < array.length; i++) {
print(array[i]);
}
// ==== 2. 算術運算 ====
var a = 10;
var b = 3;
sum = a + b;
difference = a - b;
product = a * b;
quotient = a / b;
x = 5;
y = 7;
x += 1; // x = 6
y *= 2; // y = 14
print("Sum: " + sum);
print("Difference: " + difference);
print("Product: " + product);
print("Quotient: " + quotient);
print("x after +=1: " + x);
print("y after *=2: " + y);
// ==== 3. 邏輯運算 ====
var value = 75;
var threshold = 50;
if (value > threshold) {
print("Above threshold");
}
var x_val = 10;
var y_val = 20;
if (x_val > 0 && y_val < 100) {
print("Within range");
}
if (x_val < 0 || y_val > 100) {
print("Out of range");
} else {
print("Safe range");
}
// 建立測試影像
newImage("Test", "8-bit black", 256, 256, 1);
print("Image created: " + getTitle());
// 獲取影像尺寸
width = getWidth();
height = getHeight();
print("Width: " + width + ", Height: " + height);
// 設定與讀取像素值
x = 100;
y = 100;
setPixel(x, y, 255); // 設定像素為白色
value = getPixel(x, y); // 讀取像素值
print("Pixel value at (" + x + "," + y + "): " + value);
// ==== 2. 用戶交互 ====
// 對話框輸入數字
Dialog.create("Input Example");
Dialog.addNumber("Value:", 0);
Dialog.show();
userValue = Dialog.getNumber();
print("User entered value: " + userValue);
// 文件選擇
filePath = File.openDialog("選擇檔案");
print("你選擇的檔案: " + filePath);
// ================================
// ImageJ Macro 範例：生成 Stack 並分析每個 slice
// ================================
macro "Generate Stack and Analyze" {
// ==== 1. 生成 Stack ====
width = 256;
height = 256;
n = 5; // Stack 幀數
newImage("StackExample", "8-bit black", width, height, n);
// 填充每一幀測試數據 (隨機亮點)
for (i = 1; i <= n; i++) {
setSlice(i);
for (j = 0; j < 100; j++) { // 100 個隨機亮點
x = floor(random() * width);
y = floor(random() * height);
setPixel(x, y, 255);
}
}
print("Stack created with " + nSlices + " slices.");
// ==== 2. 設置測量參數 ====
run("Set Measurements...", "integrated display redirect=None decimal=3");
// ==== 3. 對每一 slice 分析 ====
waitForUser("圈選區域");
setTool(0);
for (i = 1; i <= n; i++) {
setSlice(i);
run("Measure");
}
print("Stack analysis completed.");
}
巨集可以與使用者進行互動，例如顯示訊息、請求使用者輸入參數。 這使得巨集更加靈活，可以適應不同的影像和需求。
// 範例：彈出對話框讓使用者輸入粒子分析的最小尺寸
Dialog.create("粒子分析參數");
Dialog.addNumber("最小粒子尺寸 (pixels):", 100);
Dialog.show();
minSize = Dialog.getNumber();
if (minSize > 0) {
run("Analyze Particles...", "size=" + minSize + "-Infinity display");
} else {
print("最小尺寸無效，跳過分析。");
}
// ===== 主流程 Macro =====
macro "產生粒子範例並測量" {
// ==== 1. 生成範例影像 ====
imageN = 5; // 生成 5 張範例影像
width = 512;
height = 512;
imgDir = getDirectory("選擇存檔資料夾");
generateSampleImages(imgDir, imageN, width, height);
// ==== 2. 批次處理生成的範例影像 ====
files = getFileList(imgDir);
for (i = 0; i < files.length; i++) {
if (endsWith(files[i], ".tif")) {
processFile(imgDir + files[i]);
}
}
// 將 summary 表格輸出到 CSV
outputDir = getDirectory("選擇選擇要輸出的資料夾");
resultsFile = outputDir + "測量結果.csv";
saveAs("Results", resultsFile);
}
// ===== 生成範例影像 =====
function generateSampleImages(imgDir, imageN, width, height) {
for (i = 1; i <= imageN; i++) {
newImage("Sample_" + i, "8-bit black", width, height, 1);
// 生成隨機亮點
for (j = 0; j < 50; j++) { // 50 個亮點
x = floor(random() * width);
y = floor(random() * height);
setPixel(x, y, 255);
}
saveAs("Tiff", imgDir + "Sample_" + i + ".tif");
close();
}
}
// ===== 測量 =====
function processFile(inputPath) {
open(inputPath);
// 測量粒子
run("Set Measurements...", "area mean min max centroid redirect=None decimal=2");
run("Analyze Particles...", "size=1-Infinity show=Nothing summarize");
close();
}
本教學文章的資料來源：TrackMate version 7 novelties.pdf TrackMate 是 Fiji 影像處理軟體中一個強大且模組化的外掛程式，專門用於自動化追蹤影像中的粒子或物體，並支援手動校正和半自動追蹤。它將追蹤過程分為幾個主要步驟：
啟動 TrackMate ：執行 Plugins > Tracking > TrackMate。
Image > Properties 在 Fiji 中修改影像的metadata，然後回到 TrackMate 面板點擊 Refresh source 按鈕來更新資訊。TrackMate 提供多種偵測演算法來識別影像中的物體。偵測器負責找出影像中的點(Spots) 或輪廓，並為其提供基本的數值特徵，例如座標、半徑和品質。
DoG detector
Hessian detector
Label-Image detector (標籤影像偵測器)：從標籤影像中建立物體。標籤影像中每個物體由不同的整數值表示，這有助於分離接觸的物體。
LoG detector
Manual annotation
Mask detector (遮罩偵測器)：從二值化遮罩影像中建立物體。物體由像素值大於 0 的連通區域組成。通常會將遮罩作為原始影像的一個額外通道。
Thresholding detector (閾值偵測器)：從灰階影像中，根據指定閾值來分割物體。
以下有安裝其他外掛才會出現
此面板讓你選擇追蹤結果的顯示方式：
這個面板允許你根據偵測到的點的數值特徵（例如大小、形狀、位置或訊號強度）來進一步篩選點。
+ 按鈕來添加一個新的過濾器。此面板讓你選擇粒子追蹤的演算法，即「追蹤器」(Tracker)。追蹤器會將偵測到的點連結起來，形成完整的軌跡 (Tracks)。
LAP trackers：LAP 追蹤器，基於線性分配問題 (LAP，Linear Assignment Problem)。適用於布朗運動的粒子，在粒子密度不高時也適用於非布朗運動。
Kalman tracker：基於Kalman filter去預測等速粒子移動的軌跡。
Kalman濾波器的設定
追蹤完成後，你會進入「軌跡過濾」面板，可以根據軌跡的屬性（例如長度、速度或位置）移除不相關的軌跡。你可以添加多個過濾器，例如 Track duration (軌跡持續時間)，設定一個閾值來移除過短的軌跡（例如，移除那些進出視野的細胞）。
此面板讓你自訂點和軌跡的顯示方式。
Edit settings (編輯設定) 可以進一步調整顯示選項，例如繪製填滿的點 (draw spots filled) 或線條粗細 (line thickness)。在「顯示選項」面板的底部，你通常會找到匯出結果的按鈕。
Tracks (軌跡) 按鈕，你可以選擇匯出 Spots (點)、Edges (連結) 和 Tracks (軌跡) 的數值特徵資料為 .csv 文件。這些文件可以用於其他軟體（如 MATLAB）進行進一步分析。此面板允許你將點、連結或軌跡的任何數值特徵繪製成圖表。
Plot features (繪製特徵) 按鈕生成圖表。右鍵點擊圖表可以匯出為 PDF、PNG、SVG 影像或 CSV 數據。這是 TrackMate 工作流程的最後一個面板，你可以在此執行各種最終操作。
Execute (執行)，彈出視窗中你可以定義要保存的時間間隔。TrackMate 將生成一個帶有追蹤疊加的視訊。File (檔案) > Save as...)。即使自動追蹤的結果很好，在複雜情況下仍可能需要手動校正。
A 鍵：在滑鼠位置新增一個點。D 鍵：刪除滑鼠下的點。Space (按住) + 滑鼠移動：移動滑鼠下的點。Q / E 鍵：減小 / 增大點的半徑。Shift + Click)，然後按下 L 鍵可以建立或刪除它們之間的連結。Mask DetectorLAP tracker有了細胞形狀及其譜系後，可以追蹤細胞分裂時形狀如何變化。例如繪製底部細胞的細胞核大小和圓度隨時間的變化。
+ 按鈕以添加第二個特徵列表，然後選擇 Circularity (圓度) 特徵。
SNT 目前是透過 Fiji 的 Neuroanatomy 更新站點進行分發。
第一次從 Fiji 選單 (Plugins › Neuroanatomy › SNT) 啟動 SNT 時，系統應該會提示自動下載所需的相依套件。如果沒有出現提示：
Help › Update…)。Manage update sites。Neuroanatomy 更新站點。Apply changes 並重新啟動 Fiji。File > Autotrace Segmented Image..進行設定Utitlities > Extract Paths from Segmented Image...S 鍵： 切換游標自動吸附功能。預設情況下，游標會自動吸附到附近最亮的像素。若要手動控制節點位置，可以按 S 鍵關閉此功能。C 或 Esc 鍵： 若自動搜尋進度不佳，可以按 C 或 Esc 取消搜尋，然後選擇一個離起點更近的點重新嘗試。Z 鍵（在 Cursor Auto-snapping 面板中設定）： 將 Z 值增加到大於 0，可以讓游標在移動時自動在 Z 平面進行導航，幫助你找到最亮的體素。Y 鍵： 當 SNT 找到路徑後，會顯示為青色（臨時路徑），並詢問是否確認。如果路徑符合預期，按 Y 確認。確認後，路徑會變成紅色。N 鍵： 如果路徑不正確，按 N 拒絕，程式會回到上一步，讓您重新選擇後續點。F 鍵： 當您完成這條路徑的追蹤後，按 F 結束路徑。完成的路徑會顯示為洋紅色，程式回到步驟 I，準備開始新路徑。小提示： 熟練後，您可以在 Options 選項卡下的 Temporary Paths 區塊中關閉臨時路徑的確認步驟，以加快追蹤速度。
G 鍵： 將滑鼠游標移到目標路徑附近，然後按 G 來選中它。選中後，路徑會顯示為預設的綠色。Select Paths by 2D ROI： 在影像上畫一個粗略的 2D 範圍，選取範圍內的路徑。Alt + Shift + 左鍵點擊： 按住這兩個鍵，將滑鼠移到分岔點，你會看到游標變成一個帶有「Fork Point」標註的紅色十字。在此點擊左鍵，即可強制在新路徑的起點建立分岔。Fork at Nearest Node： 另一種方式是放大到分岔點，然後右鍵點擊影像，從右鍵選單中選擇此選項。一旦選定分岔點，就可以像追蹤新路徑一樣，依照上述步驟繼續延伸路徑（建立臨時路徑並確認）。當您完成這條分岔路徑時，在路徑管理器中會看到它被記錄為原始路徑的「子路徑」。
小提示： 您也可以在 Options 選項卡下的 Temporary Paths 區塊中簡化分岔的快速鍵組合。
本方法要求 XY、ZY 和 XZ 視圖都可見，以實現精確定位。
Shift 鍵同步所有視圖。Main 標籤頁中啟用「游標自動吸附」，讓游標自動吸附到局部最大值。紅色十字游標會標示最有可能的位置。+ 鍵放大，所有視窗都會以游標位置為中心放大。每次放大後，請確保游標仍停留在目標結構上。您可以在 Options 選項卡的 Views 元件中調整是否同步所有視圖的縮放。Shift 鍵同步視圖。S 鍵： 隨時按 S 可切換自動吸附。M 鍵： 按 M 可「點擊」體素列中最亮的體素。Refine/Fit › Fit Path... 選項，將路徑對齊到結構的中線。舊版 3D 查看器允許在 3D 場景中進行追蹤。
3D 選單中，選擇 Legacy 3D Viewer。在 Viewer 下拉選單中選擇 New with image… 並按下 Apply。W 鍵激活「魔術棒工具」，然後在 3D 場景中點擊。追蹤方式與 2D 相同。Alt + Shift 進行分岔。H 鍵激活「手形工具」來與場景互動。Shift + 滑鼠中鍵並拖曳。如果手形工具激活，可使用 Shift + 左鍵拖曳。Path Editing。您可以在 Edit Mode 中合併或連接兩條路徑。
Edit Mode。G 鍵選擇第二條路徑，並懸停在第二個合併節點上。Connect To (Start Join) 或 Connect To (End Join) 選單中選擇第一條路徑。重要提示： - 只有當至少一個節點是末端節點時才能合併，以避免創建循環。 - 合併方向從父路徑到子路徑。如果方向錯誤，SNT 會自動重新定向。 - 禁止創建循環連接。 - 推薦使用路徑管理器 (Path Manager) 中的
Edit選單來合併或連接路徑。
在 SNT 中，要獲取所有突起（或稱分支、枝芽）的長度，您主要會使用「Measurements (測量)」功能。SNT 提供了多種方式來進行測量，具體取決於您是想測量整個細胞的突起，還是選定部分路徑的突起。
如果您想測量一個完整的、已經重建好的細胞（SNT 稱之為「connected component」，即有根的樹狀結構）的所有突起長度，可以這樣操作：
Analysis › Measure…。Analyze & Measure ›。OK 或 Measure）來執行測量。SNT 會輸出一個表格，其中包含您選擇的所有指標的數據。如果您只想測量 Path Manager 中選定的一組路徑（例如，您只對某個特定區域或特定分支的枝芽長度感興趣），則可以透過 Path Manager 進行操作：
Analyze › Measurements。區分細胞級和路徑級測量的重要性： SNT 區分了這兩類測量是為了提供靈活性： - 路徑級測量可以對任何結構執行，甚至是有循環 (loops) 的結構。 - 細胞級測量要求結構必須是一個圖論樹 (graph-theoretic tree)（即沒有循環，每個節點只有一條通往根部的路徑）。
大部分 SNT 測量指標在 Metrics 頁面有詳細描述。GUI 中可用的測量通常是單一值的指標，而許多其他測量則可以透過腳本來獲取。
SNT 還提供了一個便利的 Quick Measurements 命令：
Analysis 選單中。Analyze & Measure 選單中。這個命令會使用預設設定立即檢索常用指標，無需額外的提示。
NaN。您可以考慮使用「原地擬合 (Replace existing nodes)」選項來擬合路徑，或使用 Path Manager 的 Edit › Rebuild… 命令來重新計算路徑之間的關係。Comparing Reconstructions 中有詳細描述。
分割粒線體
3D 呈現
特徵計算
Image › Stacks › 3D Project...取 min intensity取得具有完整影像的範圍，再套用到原始stack進行crop。
複製出單一slice，進行FFT，測試產生頻譜圖。在頻譜圖上進行處理，將週期性結構去除，並將頻譜圖轉回空間域。
將處理後的頻譜圖，利用Image > Adjust > Threshold...進行二值化處理，目標是阻擋的頻率範圍為黑色，允許通過的頻率為白色。
利用Process › FFT › Custom Filter...套用上述頻譜圖，將原始影像stack中的週期性結構去除。
使用 Plugins › Segmentation › Trainable Weka Segmentation 3D進行處理，class1作為背景或非粒線體，class2作為粒線體。
使用freehand line tool標註粒線體與背景。
使用適中寬度的freehand line：設置stroke width為3-5像素，沿著粒線體中心線繪製：這樣可以捕獲粒線體的主要特徵，在多個切片上標註：確保3D結構的完整性。
training後，得到的結果影像為二值化影像。
使用Analyze › 3D Objects Counter將二值化影像切割成各個粒線體。每個粒線體都會有一個獨立的ID。且可以得到分析表格，其中包含每個粒線體的體積資訊。
利用Image > Adjust > Threshold...用單一粒線體的ID，並將其轉換為二值化影像。
此二值化影像與原始影像進行Image › Calculator Plus...，選擇AND運算，將原始影像中非粒線體的部分去除。即可得到分割後的粒線體影像。
Plugins › 3D Viewer進行3D重建。可看到分割後的粒線體的立體影像。
以 t1-header.tif 這組 T1 加權的腦部 MRI 影像為範例，學習如何使用 ImageJ/Fiji 進行基礎的影像分割，將感興趣的解剖結構，如腦組織（Brain）和頭骨（Skull），分離出來，並進行 3D 視覺化呈現。
t1-header.tif這是一套包含 129 張連續切片的 T1 加權 MRI 影像堆疊（Image Stack）。
t1-header.tif 檔案拖曳至 Fiji/ImageJ 視窗，或使用 File > Open...。Image > Stacks > Orthogonal Views 可以同時從三個正交平面（橫斷面、冠狀面、矢狀面）觀察影像，這對於理解 3D 結構非常有幫助。Plugins > 3D viewer或是 Plugints > Volumln Viewer我們的目標是建立一個只包含腦組織的二值化遮罩 (Binary Mask)，你可以先用之前學過的Image > Adjust > Threshold...進行處理，目標是讓腦組織（腦灰質與白質）被完整選取，同時盡可能排除周圍的腦脊髓液和頭骨。如果需要可以再後續用形態學處理來清理空洞與雜訊。
除了上述手動方法外，我們將利用機器學習來進行分割。
當腦組織和頭骨的灰階強度非常相似時，單純的閾值分割會失敗。此時，可以用 Fiji 內建的 Trainable Weka Segmentation ，它不僅只靠灰階值，還能學習紋理、邊緣等特徵，分割效果更佳。
開啟插件與設定：
t1-header.tif 影像。Plugins > Segmentation > Trainable Weka Segmentation。Settings，確認 Training features 中的選項（預設即可）。Create new class 建立三個類別，並分別命名為 Brain, Other, Background。提供訓練樣本 (Training)：
Brain 類別。使用 選取工具，在影像的腦組織區域畫幾個小圈，每畫一個就點擊 Add to class 'Brain' 按鈕。技巧： 請在不同的腦區（灰質、白質）和不同的 Z-slice 上都提供樣本。Skull 類別，在頭骨的亮色區域畫圈並加入。Background 類別，在腦外的黑色區域畫圈並加入。訓練與產生結果：
Train classifier 按鈕進行訓練。右側的預覽視窗會即時顯示分類結果。如果結果不理想，可以增加更多樣本並重新訓練。Create result。這會產生一張新的分類結果影像 (classified image)。從分類結果中提取腦部遮罩：
Image > Adjust > Threshold...。Brain) 的像素值通常是 1。將閾值滑桿的上下限都設為 1，這樣就只選取了腦部。Apply，即可得到一張乾淨的 Brain Mask。分離頭骨的邏輯很簡單：頭骨 = 整個頭部 - 腦組織。
建立「整個頭部」的遮罩：
t1-header.tif 影像。Image > Adjust > Threshold...。Apply 產生一個包含整個頭部（腦+頭骨）的遮罩。將其命名為 Head Mask。影像計算 (Image Calculator)：
Process > Image Calculator...。Image1: 選擇 Head Mask。Operation: 選擇 Subtract (減去)。Image2: 選擇我們在步驟一得到的 Brain Mask。OK。得到頭骨遮罩：
Skull Mask。現在我們有了各自獨立的 Brain Mask 和 Skull Mask，可以使用 3D Viewer 將它們視覺化。
啟動 3D Viewer：
Plugins > 3D > 3D Viewer。加入腦組織表面：
Add > Surface...。Image 下拉選單中選擇 Brain Mask。Name: 可命名為 Brain。Color: 選擇一個您喜歡的顏色，例如灰色。Threshold: 設為 1。Transparency: 設定一個透明度，例如 50%，這樣才能看到內部。OK。加入頭骨表面：
Add > Surface...。Image: 選擇 Skull Mask。Name: 可命名為 Skull。Color: 選擇白色或淡黃色。Threshold: 設為 1。Transparency: 設為一個較低的值，例如 20%。OK。現在，您應該可以在 3D Viewer 中看到半透明的頭骨包覆著腦組織的立體模型。您可以用滑鼠自由地旋轉和縮放，從不同角度觀察這些結構。
這些產生的遮罩（Masks）不僅可用於視覺化，也可以進行定量分析。例如對 Brain Mask 影像堆疊執行 Analyze > Histogram，並將 Count（像素數）乘以每個體素（Voxel）的體積，就可以估算出總腦容量。
體積計算的邏輯是：
總體積 = 體素(Voxel)的總數量 × 單一體素的體積
Brain Mask）中，這就是所有白色像素的總和。根據此 MRI 數據集的Image > Properties...，其體素尺寸為 1.5 mm × 1.5 mm × 1.5 mm。
我們將以計算 腦組織體積 為例。。
在進行任何測量之前，必須先讓 ImageJ 知道影像的真實尺度。
Brain Mask 或任何一張原始影像堆疊。Image > Properties... (快捷鍵 Ctrl+Shift+P)。Unit of length: mmPixel width: 1.5Pixel height: 1.5Voxel depth: 1.5 (這是 Z 軸的尺寸，即切片厚度)Global，這樣此設定會應用到所有開啟的影像。OK。完成後，影像視窗的標題會顯示校正後的尺寸。
有兩種推薦的方法可以得到體積。
方法 A：使用直方圖 (Histogram)
此方法讓您了解背後的計算過程。
Brain Mask 影像堆疊。Analyze > Histogram (快捷鍵 Ctrl+H)。Value 為 255 的那一列，其對應的 Count 值就是白色體素的總數量，將這個數字與單一體素體積相乘，就可以得到腦的體積。方法 B：使用 3D 物件計數器 (3D Object Counter) (更直接)
Fiji 內建的強大 3D 分析工具可以直接給出校正後的體積。
Brain Mask 影像堆疊。Analyze > 3D OC Options 來設定參數，確保 Volume 已被勾選。Analyze > 3D Object Counter。Threshold 設為一個介於 1-255 之間的值 (例如 128)，以確保只計算白色物件。OK。Volume 欄位直接顯示了計算好的體積（單位為 mm³），並且 Voxels 欄位顯示了體素總數，與直方圖方法得到的結果一致。我們已經學會了如何從 MRI 影像中分割出大腦並計算其體積。然而，體積只是描述一個三維物體最基礎的參數。大腦最顯著的特徵之一是其表面佈滿了複雜的溝（Sulci）與迴（Gyri），這極大地增加了其表面積。
使用 ImageJ/Fiji 來測量更進階的 3D 形態學 (Morphometry) 參數，如表面積 (Surface Area) 和球形度 (Sphericity)，從而量化大腦的結構複雜度。
球形度是一個用來描述物體形狀有多麼接近完美球體的無因次參數。其值範圍在 0 到 1 之間： - 值為 1： 表示物體是一個完美的球體。 - 值越接近 0： 表示物體形狀越不規則、越扁平或越細長。
其計算公式為：
Sphericity = (π^(1/3) * (6 * Volume)^(2/3)) / Surface Area
從公式可以看出，在體積 (Volume) 相同的情況下，表面積 (Surface Area) 越大的物體，其球形度就越低。對於大腦而言，複雜的溝迴結構使其在有限的顱腔體積內容納了巨大的皮層表面積，因此其球形度會遠低於一個同樣體積的光滑球體。
使用在Brain Mask 作為分析對象。
t1-header.tif 影像並依照先前教學產生 Brain Mask 影像堆疊。Image > Properties...，體素尺寸為 1.5 x 1.5 x 1.5 mm)。這一步對於計算真實的物理表面積和體積至關重要。Brain Mask 影像堆疊。Analyze > 3D Object Counter。Threshold: 設為一個介於 1-255 的值（例如 128），以確保只計算白色物件。Min. Voxel: 設為一個較大的值（如 1000），以過濾掉可能的微小雜訊。Volumes 和 Surface areas 這兩個選項都被勾選。OK。分析完成後，會彈出一個 "3D Results" 表格。
Volume [mm^3]: 這就是我們之前計算過的大腦體積。Surface [mm^2]: 這就是大腦的總表面積。使用這兩個值，代入公式計算大腦的球形度。
我們將以 ImageJ 內建的 Fluorescent Cells.tif 範例影像為基礎，學習影像強度的定量。
File > Open Samples > Fluorescent Cells.tif。我們的目標是定量分析微管蛋白（綠色通道）在細胞核與細胞質中的螢光強度。
這個影像目前是以「Composite Mode」（合成模式）來顯示，它將多個獨立的灰階通道（每個通道通常指定不同的偽彩色，例如通道 1 為紅色，通道 2 為綠色，通道 3 為藍色）疊加在一起顯示，形成一個合成的彩色影像，方便同時觀察所有通道的訊號，並視覺化它們之間的空間關係（共定位）。雖然它看起來像一個 RGB 影像，但底層的數據仍然是分離的灰階通道。
Image › Color › Channels Tool...可以切換顯示的模式，可以切換成Color或Grayscale模式。
為了分別觀察不同通道的影像品質，請利用Image › Color › Split Channels將影像分成不同通道來分析。
在進行量化影像前，我們必須注意影像的幾項品質:
使用放大鏡工具放大影像，是否會看到 8x8的方形偽影(square shaped artifacts)。若有，可能被進行過JPEG 壓縮，因為JPEG是基於 8x8 像素區塊進行壓縮的演算法，每個區塊都會損失各自的高頻訊號，因此彼此區塊會產生不連續的界面，產生明顯區塊邊界。
影像採樣時，進入偵測器的光線量過多，超出了偵測器所能線性響應的範圍，因此產生飽和(saturated)，這會使得感測器的讀數限制在最大值（例如255），超過這個數字的都會被剪切(clipped)，因此會觀察到過度曝光(overexposed)。
我們可以針對個別通道進行Analyze > Histogram觀察個別通道的最高像素值的數量(例如pixel value = 255 )，你可以勾選Log，讓數量少的數值也能清楚顯示在直方圖上（Y軸非線性顯示，而是變成對數）。
請注意藍色通道中的直方圖，強度值255的像素數量有108個。（也許真實強度有高於255的，但卻被剪切了）
當沒有任何光子進入偵測器，理論上偵測器應該會採樣到0值，但如果產生偵測器偏移（detector offset），則應該是黑色的區域就會產生非零的數值。你可以用兩種方式檢查：
Pixel inspector，觀察應該黑色的部位是否非零。請觀察綠色通道的直方圖和另外兩個通道的直方圖差異。
如果影像產生這種offset，則在後續做共定位分析時，需要進行背景減除(Background Subtraction)或零偏移校正(Zero Offset Correction / Bias Correction)的，否則會影響一些需要用像素絕對強度來運算的係數，例如Manders係數。
校正的目的是為了去除所有來自非目標分子或環境的光學噪音，突出真實的訊號。（想像一下大家都站在箱子上量身高，最後得到的身高應該如何校正回真實身高？）
操作方式：
手動選擇背景區域：在影像的空白區域（例如細胞周圍沒有螢光的區域）測量平均強度，然後從整個影像中減去這個值。（結果可能產生負值，但因為是8-bit影像，所以最小值會成為0）
Analyze > Measure或 Ctrl+M 來獲取該區域的平均像素值。Process > Math > Subtract...扣除該數值使用內建的背景分離Process > Subtract Background...
拍攝背景影像：拍攝一個不含目標染料但具有所有其他樣品成分和培養條件的空白樣品影像，然後從實驗影像中減去它。
Image > Stacks > Z Project...，選擇 Average）。這張平均影像就是你的「偏置主幀 (Master Bias Frame)」。Process > Image Calculator...，操作選擇 Subtract個通道分別拍攝和減除。在開始分析前，先設定需要測量哪些數據。
Analyze > Set Measurements...。Area: 物件的面積。Mean gray value: 訊號的平均強度。Integrated Density: 訊號的總量（= Area × Mean gray value）。Display label: 在結果中顯示影像標籤，方便識別數據來自哪個影像。OK。DAPI的藍色通道有清晰的細胞核輪廓，可以用來定義細胞核的選區 (ROI)。
Image > Color > Split Channels。執行Image > Rename..重新命名成 red, green, blue 三張獨立的灰階影像。(blue) 這張影像。Image > Adjust > Threshold... 來選取細胞核。Apply 將其轉換為二值化影像。Analyze > Analyze Particles...。Size 來過濾掉小雜訊，例如 50-Infinity。Add to Manager，然後點擊 OK，所有細胞核的輪廓都被加入到 ROI manager中了。選取 (red) 通道影像，因為能大致顯示整個細胞的輪廓。
Image > Duplicate..，複製一張，接下來的操作都用這張圖來運算。Edit › Selection › Make Inverse，這會變成選取細胞之外的部份。再執行Edit > Clear，這可以讓細胞之外的區域都清除。再執行一次Edit › Selection › Make Inverse，又可以選回原來的細胞範圍。Image > Adjust > Threshold..選擇出細胞的精細範圍，中間有洞沒關係。按下apply，此影像會轉成遮罩影像。Process › Binary › Fill Holes，可以將細胞之間的界線填滿，這樣就產生一個細胞精細輪廓的二值化遮罩影像。Edit › Selection › Create Selection，可以將其轉為選區，在 ROI Manager按下Add，就可以有單獨一個細胞的ROI。可以點擊 Rename... 將其命名為 Cell-1。Nu-1。More >> 按鈕，選擇 XOR。(XOR是互斥，請理解成「有你就沒有我，有我就沒有你」)Cyto-1。Cyto-1之後，執行Edit › Selection › Create Mask，就可以看見這個甜甜圈形狀的細胞質。現在，我們的 ROI manager中應該至少有三個 ROI：Nu-1、Cell-1 和 Cyto-1。
你可以針對單一影像的多個ROI進行測量，也可以針對一個stack的每個slice，作多個ROI的測量。
單一影像，多個ROI的測量
Measure單一stack，多個ROI的測量
Fluorescent Cells.tif，或是將已經經過背景扣除的三張影像再透過Image > Color > Merge Channels或是Imagew > Stacks > Images to Stack組合成stack。More >> 按鈕，然後選擇 Multi Measure。在完成細胞核、細胞質、細胞區域的 ROI 定義後，我們可以直接進行螢光通道的共定位分析。以下以 ImageJ 內建的 Coloc2 工具為例，說明操作流程與指標解讀。
準備影像與 ROI
啟動 Coloc2 分析
Analyze > Colocalization Analysis > Coloc 2。執行與結果解讀
在許多生物影像中，我們需要一次測量多個物件（例如細胞、胚胎）。手動一個個圈選不僅耗時，也容易出錯。本章節將以 embryos.jpg 範例影像為例，進行標準的自動化分析流程：從影像分割、形態學處理，到使用 ROI Manager 進行批次測量。
在進行任何測量之前，首要步驟是確保影像設定正確，讓後續的數據具有科學意義。
File > Open Samples > Embryos.jpg。Analyze > Set Scale... 來設定。。Analyze > Set Measurements...。Area、Mean gray value、Perimeter、Fit Ellipse 和 Shape descriptors。OK。此設定將會應用於後續所有的測量指令。此流程適用於快速、大量地處理特徵較為一致的物件。
我們的目標是產生一張黑白分明的二值化遮罩 (Binary Mask)，其中白色代表胚胎，黑色代表背景。
Image > Type > 8-bit。Image > Adjust > Threshold... (快捷鍵 Ctrl+Shift+T)。ImageJ 會自動選擇一個閾值，觀察影像，大部分胚胎應該被標示為紅色。點擊 Apply，將影像轉換為黑白的二值化影像。此時我們的分割結果可能不完美，這可以用形態學處理解決。
目標是得到一張乾淨、且每個胚胎都獨立分開的二值化遮罩。
現在，我們使用 Analyze Particles 功能來自動偵測所有胚胎，並將它們的輪廓統一交給 ROI manager。
Analyze > Analyze Particles...。Size (pixel^2): 設定一個合理的範圍，例如 500-Infinity，以過濾掉分割後可能殘留的微小雜訊點。Show: 選擇 Outlines。這會產生一張新的影像，顯示所有被偵測到的物體輪廓。Display results：顯示測量結果表格。Add to Manager：此選項會將每一個被偵測到的物體輪廓作為一個獨立的 ROI，自動加入到 ROI manager中。OK。雖然自動化流程很強大，但有時你需要測量的目標不規則、自動分割效果不佳，或只想分析其中幾個特定物件。在這種情況下，手動選取結合ROI manager是更精確、更靈活的方法。
Analyze > Tools > ROI Manager...。Add [t] 按鈕。第一個胚胎的選區 (ROI) 就被儲存起來了。無論是透過自動還是手動流程，最終我們都得到了一個包含多個選區的 ROI manager。
在 ROI manager視窗中，點擊 Measure 按鈕。ImageJ 會對清單中的每一個 ROI 進行測量，並將結果逐行顯示在 "Results" 表格中。
Results > Summarize。Area），使其反白。Results > Distribution...，ImageJ 會產生該欄數據的直方圖，讓你直觀地看到分佈情況。File > Save As...。.csv 格式。這個檔案可以輕易地被 Excel、Google Sheets 或其他統計軟體開啟，以進行更深入的分析與圖表繪製。ROI manager的其他功能：
Show All，所有胚胎的輪廓會被顯示在原始影像上。Labels，每個 ROI 的編號會被標示在影像上，你可以對應影像上的胚胎與 "Results" 表格中的數據。Delete 刪除特定的 ROI，或用 Rename 重新命名。Save... 可以將這一整組 ROI 儲存成一個 .zip 檔案，方便未來重新載入 (Open...) 進行分析，無需重複前面的分割步驟。
除了強度和形狀，紋理 (Texture) 描述了像素鄰域內的空間強度變化模式，如粗糙、平滑、規律等。
本單元介紹紋理分析的基本概念，並以灰階共生矩陣 (Gray-Level Co-occurrence Matrix, GLCM) 為例，用 ImageJ/Fiji 實作 MRI 腦組織分析案例，分析灰白質的紋理特徵。
影像紋理是指影像中像素灰階分佈的局部變化模式。它不是描述單一像素，而是描述像素與其周圍鄰居的空間關係。這些模式可以被量化為特徵，例如：
紋理特徵能夠補充形狀與強度資訊，是生醫影像分析中量化影像細微變化的重要工具。
紋理分析的核心是量化影像中像素間的「灰階關係」，通常從以下角度描述：
紋理分析在醫學影像中應用廣泛，能輔助電腦進行診斷與分類：
GLCM互動範例
灰階共生矩陣 (Gray-Level Co-occurrence Matrix, GLCM) 是最經典的紋理分析統計方法。它透過一個矩陣來描述影像中像素的空間關係。這個矩陣記錄了在特定方向 (Angle) 和距離 (Distance) 下，成對像素的灰階值共同出現的頻率。
舉例來說，當設定 方向=0°、距離=1 時，GLCM 統計的就是影像中每個像素與其正右方相鄰像素的灰階值組合出現了幾次。
假設有一張 \(3 \times 3\) 的灰階影像如下：
| 100 | 100 | 101 |
| 100 | 101 | 102 |
| 101 | 102 | 102 |
這裡的灰階值只有：100、101、102。
只考慮每個像素與右邊像素的組合關係。
從影像中列出右側鄰居的像素對：
列出灰階對應次數：
| i\j | 100 | 101 | 102 |
|---|---|---|---|
| 100 | 1 | 2 | 0 |
| 101 | 0 | 0 | 2 |
| 102 | 0 | 0 | 0 |
將所有出現次數除以總像素對數（5 對）：
| i\j | 100 | 101 | 102 |
|---|---|---|---|
| 100 | 0.2 | 0.4 | 0 |
| 101 | 0 | 0 | 0.4 |
| 102 | 0 | 0 | 0 |
(1) Contrast（對比度）
計算各元素：
加總：
(2) Homogeneity（均勻性）
計算各元素：
加總：
(3) Entropy（熵）
計算各元素（取對數基底 2）：
加總：
這張小影像的 GLCM 特徵是：
| 特徵 | 數值 |
|---|---|
| Contrast | 0.8 |
| Homogeneity | 0.6 |
| Entropy | 1.52 |
File > Open Samples > T1 Head (2.4M, 16-bits)。Analyze > Tools > ROI Manager...。macro "Main" {
step = 1;
calculateASM = true;
calculateContrast = true;
calculateCorrelation = true;
calculateIDM = true;
calculateEntropy = true;
run("Clear Results");
n = roiManager("count");
if (n == 0) exit("ROI Manager 中沒有 ROI");
for (i = 0; i < n; i++) {
roiManager("select", i);
GLCM_Texture_Macro(i, step, calculateASM, calculateContrast, calculateCorrelation, calculateIDM, calculateEntropy);
}
print("GLCM Texture analysis done for " + n + " ROIs.");
}
function GLCM_Texture_Macro(roiIndex, step, doASM, doContrast, doCorrelation, doIDM, doEntropy) {
if (bitDepth() != 8) {
exit("僅支援8-bit灰階影像");
}
getSelectionBounds(x, y, w, h);
pixels = newArray(w * h);
idx = 0;
for (yy = y; yy < y + h; yy++) {
for (xx = x; xx < x + w; xx++) {
pixels[idx] = getPixel(xx, yy);
idx++;
}
}
size = 257;
glcm = newArray(size * size);
Array.fill(glcm, 0);
pixelCounter = 0;
// 0度方向 GLCM
for (row = 0; row < h; row++) {
for (col = 0; col < w - step; col++) {
a = pixels[row * w + col];
b = pixels[row * w + col + step];
index1 = a * size + b;
index2 = b * size + a;
glcm[index1] += 1;
glcm[index2] += 1;
pixelCounter += 2;
}
}
for (i = 0; i < size * size; i++) {
glcm[i] /= pixelCounter;
}
asm = 0;
contrast = 0;
correlation = 0;
IDM = 0;
entropy = 0;
px = 0;
py = 0;
for (a = 0; a < size; a++) {
for (b = 0; b < size; b++) {
val = glcm[a * size + b];
px += a * val;
py += b * val;
}
}
stdevx = 0;
stdevy = 0;
for (a = 0; a < size; a++) {
for (b = 0; b < size; b++) {
val = glcm[a * size + b];
stdevx += (a - px) * (a - px) * val;
stdevy += (b - py) * (b - py) * val;
}
}
for (a = 0; a < size; a++) {
for (b = 0; b < size; b++) {
val = glcm[a * size + b];
asm += val * val;
contrast += (a - b) * (a - b) * val;
if (stdevx != 0 && stdevy != 0) {
correlation += ((a - px) * (b - py) * val) / (stdevx * stdevy);
}
IDM += val / (1 + (a - b) * (a - b));
if (val > 0) {
entropy -= val * log(val);
}
}
}
nRows = nResults();
setResult("ROI Index", nRows, roiIndex + 1);
setResult("Step size", nRows, step);
setResult("ROI Name", nRows, Roi.getName);
setResult("Angular Second Moment", nRows, asm);
setResult("Contrast", nRows, contrast);
setResult("Correlation", nRows, correlation);
setResult("Inverse Difference Moment", nRows, IDM);
setResult("Entropy", nRows, entropy);
updateResults();
print("ROI " + (roiIndex + 1) + " GLCM features:");
print(" ASM = " + asm);
print(" Contrast = " + contrast);
print(" Correlation = " + correlation);
print(" IDM = " + IDM);
print(" Entropy = " + entropy);
}
我們需要在典型的灰質和白質區域手動定義幾個 ROI 以進行比較。
Image › Duplicate...，複製其中一張影像。Image > Type > 8-bit。Add [t]，然後點擊 Rename... 將其命名為 grey。white。觀察表格，這些數據是否符合我們對灰白質的主觀感受？白質的紋理確實比灰質更平滑、更均質，而灰質的紋理則更粗糙、更複雜。
| 特徵名 | 英文 | 意義 | 解讀 |
|---|---|---|---|
| 角秒矩 | Angular Second Moment (ASM) | 衡量紋理的均勻性或一致性 | 值越高表示紋理越規則、均勻。 |
| 對比度 | Contrast | 鄰近像素間灰階差異的加權總和，反映影像紋理的「粗糙程度」 | 高對比＝紋理粗糙 |
| 相關性 | Correlation | 衡量像素間灰階的線性相關性 | 值高表示像素間關係有序、噪音少。 |
| 反差異矩 | Inverse Difference Moment (IDM) / Homogeneity | 鄰近像素灰階越接近得分越高 | 值高表示像素強度相似，紋理平滑。 |
| 熵 | Entropy | 量化灰階分佈的隨機性，GLCM元素的平方和 | 數值高表示紋理複雜、無序。 |
Analyze > Analyze Particles...Display results, Clear results, Summarize, Add to Manager 等選項控制輸出。在執行 Analyze > Measure 或 Analyze Particles... 之前，我們可以透過 Analyze > Set Measurements... 指令來決定結果表格中要顯示哪些測量項目。了解這些參數的意義，能幫助你選擇最適合研究目的的量化指標。
以下是常用參數的說明：
| 參數 (選項) | 結果欄位 | 說明 |
|---|---|---|
| Area | Area |
選區的面積。如果影像經過空間校正，單位會是物理單位（如 cm²），否則為像素平方 (pixels²)。 |
| Mean Gray Value | Mean |
選區內所有像素的平均灰階值。若經過強度校正，則單位為校正後的物理單位。對於RGB影像，會先轉換為灰階再計算。 |
| Standard Deviation | StdDev |
選區內像素灰階值的標準差，反映了亮度的離散程度。 |
| Min & Max Gray Level | Min, Max |
選區內的最小與最大灰階值。 |
| Modal Gray Value | Mode |
選區內出現頻率最高的灰階值（眾數），對應直方圖的最高峰。 |
| Median | Median |
選區內像素灰階值的中位數。相較於平均值，較不受極端值（雜訊點）影響。 |
| Integrated Density | IntDen, RawIntDen |
積分密度。IntDen = Area × Mean；RawIntDen = 選區內所有像素的灰階值總和。在螢光定量等分析中非常重要，能反映選區內訊號的總量。 |
| Skewness | Skew |
偏度。衡量灰階分佈的不對稱性。正偏態表示分佈偏向左側（低亮度），負偏態表示偏向右側（高亮度）。 |
| Kurtosis | Kurt |
峰度。衡量灰階分佈的峰態陡峭程度。高聳的峰態有較高的峰度值。 |
| 參數 (選項) | 結果欄位 | 說明 |
|---|---|---|
| Perimeter | Perimeter |
選區的邊界長度（周長）。 |
| Centroid | X, Y |
形心（幾何中心）。選區所有像素點X、Y座標的算術平均值，代表物體的幾何中心位置。 |
| Center of Mass | XM, YM |
質心。以像素亮度為權重的座標平均值。質心會偏向選區中較亮的區域。 |
| Bounding Rectangle | BX, BY, Width, Height |
邊界矩形。能完全包圍選區的最小矩形。回傳其左上角座標(BX, BY)及寬高。 |
| Feret's Diameter | Feret, FeretAngle, MinFeret |
費雷特直徑（最大口徑）。選區邊界上任意兩點間的最長距離。MinFeret 則是最小口徑。常用來描述不規則物體的尺寸。 |
| Fit Ellipse | Major, Minor, Angle |
擬合橢圓。計算出最能貼合選區的橢圓，並回傳其長軸(Major)、短軸(Minor)及長軸與X軸的夾角(Angle)。 |
| Shape Descriptors | Circ., AR, Round, Solidity |
形狀描述子，一組用來量化形狀的指標： - Circ. (圓形度): 4π*面積/周長²。值為1.0表示完美的圓形，越接近0.0表示越狹長。- AR (長寬比): 長軸/短軸，需同時啟用 "Fit Ellipse"。- Round (圓度): 4*面積/(π*長軸²)，是長寬比的倒數。- Solidity (實心度): 面積/凸包面積。值接近1表示物體較實心、無凹陷。 |
| 參數 (選項) | 說明 |
|---|---|
| Area Fraction | 顯示被閾值（Threshold）標紅的像素所佔的面積百分比。 |
| Limit to Threshold | 勾選後，所有測量（如Mean, Min, Max）都只會計算被閾值標紅的像素，忽略選區內未被標紅的像素。這對於在不完美的分割區域中精確測量訊號非常有用。 |
| Stack Position | 在處理影像堆疊（Stack）時，記錄測量發生在哪個通道(Ch)、切片(Slice)或幀(Frame)。 |
| Display Label | 在結果表格的第一欄顯示影像名稱和切片編號，方便辨識數據來源。 |
| Redirect To | 重定向。允許你在影像A上圈選ROI，但實際測量影像B上對應位置的像素值。對於多通道分析（如在DAPI通道上圈核，測量GFP通道的強度）極為重要。 |
| Decimal Places | 設定結果表格中小數點後顯示的位數。 |
Results Table 中。File > Save As... 匯出成 .csv 或 .txt 文件，以便後續使用 Excel, Python (Pandas), R 等工具進行統計分析和繪圖。請執行這個macro，觀察不同show產生的效果。
// 建立原始影像
newImage("original", "8-bit black", 512, 512, 1);
setColor(255);
// 畫圓形
makeOval(50, 50, 100, 100);
run("Fill");
run("Select None");
// 畫方形
makeRectangle(200, 50, 100, 100);
run("Fill");
run("Select None");
// 畫三角形（使用多邊形）
makePolygon(150,300, 250,300, 200,200);
run("Fill");
run("Select None");
// Binarize（轉為二值圖）
setThreshold(1, 255);
run("Convert to Mask");
// 各種 show 模式與對應標籤
shows = newArray(
"Overlay",
"[Overlay Masks]",
"Outlines",
"[Bare Outlines]",
"Ellipses",
"Masks",
"[Count Masks]"
);
// 執行每種 show 模式
for (i = 0; i < shows.length ; i++) {
selectImage("original");
showOption = shows[i];
if (i == 0 || i == 1) run("Duplicate...", "title="+ showOption);
run("Analyze Particles...", " show=" + showOption );
wait(200); // 等待新視窗建立
idList = getList("image.titles");
newest = idList[lengthOf(idList) - 1]; // 最新產生的圖
selectImage(newest);
rename(showOption);
}
本範例展示如何在影像中加入週期性雜訊（條紋或點狀 pattern），並利用 ImageJ 觀察其傅立葉轉換（FFT）結果。
angle 參數，可觀察頻譜亮點的旋轉變化。freqX 參數，可觀察頻譜亮點的位置變化。// 在影像上增加週期性雜訊：可切換「條紋」或「點狀 pattern」
// 觀察轉出的FFT
// ==== 參數 ====
mode = "stripe"; // "stripe" = 條紋, "pattern" = 點狀
// 條紋時只用 freqX
freqX = 10; // X方向週期
freqY = 20; // Y方向週期
amp = 60; // 雜訊強度 (0~255)
angle = 30; // 旋轉角度 (度數)
// ==== 測試影像 ====
run("Clown");
run("8-bit");
rename("Noisy");
width = getWidth();
height = getHeight();
theta = angle * PI / 180;
setBatchMode(true);
for (y=0; y<height; y++) {
for (x=0; x<width; x++) {
// 旋轉座標
xp = x * cos(theta) + y * sin(theta);
yp = -x * sin(theta) + y * cos(theta);
if (mode == "stripe") {
// 條紋
value = amp * sin(2 * PI * xp / freqX);
} else {
// 點狀 pattern
value = amp * sin(2 * PI * xp / freqX) * sin(2 * PI * yp / freqY);
}
// 只增亮
//if (value < 0) value = 0;
v = getPixel(x, y) + value;
if (v > 255) v = 255;
if (v < 0) v = 0;
setPixel(x, y, v);
}
}
setBatchMode(false);
resetMinAndMax();
run("FFT");
你可以在 FFT 頻譜圖上進行處理（如遮罩、消除亮點），再做 Inverse FFT（Process › FFT › Inverse FFT）觀察效果。
Edit > Clear 或 Clear Outside。Process > FFT > Inverse FFT，即可看到雜訊被抑制的效果。在頻域中，週期性雜訊會對應到特定的頻率成分。透過傅立葉轉換，我們可以將影像從空間域轉換到頻域，並觀察到這些雜訊成分的頻譜特徵。當我們在頻譜圖上進行遮罩處理，實際上是去除了這些特定頻率的影響，進而達到去雜訊的效果。
從 FFT 頻譜圖上，你也可以使用自訂濾波器來處理影像。這可以讓你更精確地控制哪些頻率成分被保留或去除。
執行 Process › FFT › Custom Filter...。
透過自相關分析，我們可以進一步了解影像中的週期性雜訊特徵。自相關函數可以幫助我們識別影像中重複出現的模式，並為去雜訊提供依據。
Process › FFT › FD Math...，使用同一張圖做自相關運算 correlate，勾選 Do inverse transform。
形態學重建是基於形態學操作（膨脹、腐蝕），但能更精確地保留物件的原始形狀。其核心思想是使用一張「標記影像 (Marker Image)」在另一張「遮罩影像 (Mask Image)」的約束下，進行迭代式的膨脹或腐蝕，直到影像不再變化為止。
可以將灰階影像想像成一個三維的地形圖，像素的灰階值代表該點的高度。
形態學重建有兩種基本操作：
膨脹式重建 (Reconstruction by Dilation):
腐蝕式重建 (Reconstruction by Erosion):
形態學重建最常見的應用是「重建式開運算」和「重建式閉運算」，用途是影像去噪，將亮點和暗點移除。
此操作能移除影像中的小型亮點（地形圖中的「小山峰」），同時完美保留較大物件的形狀和尺寸。
此操作能填補影像中的小型暗點或孔洞（地形圖中的「小坑洞」），同時保留物件的形狀。
雖然形態學重建和中值濾波器（Median Filter）都可以用於影像去噪，但原理和適用情境有顯著差異：
| 特性 (Feature) | 形態學重建 (Morphological Reconstruction) | 中值濾波器 (Median Filter) |
|---|---|---|
| 基本原理 | 使用標記影像在遮罩影像的約束下進行迭代式膨脹/腐蝕。 | 將每個像素替換為其鄰域內像素灰階值的中位數。 |
| 形狀保留 | 極佳。能完美保留大於結構元素的物件輪廓與尺寸，不會造成收縮或變形。 | 良好，但較大半徑的濾波可能導致物件的尖角被鈍化、邊緣輕微變形。 |
| 去噪機制 | 移除尺寸小於結構元素的亮點（重建式開）或暗點（重建式閉）。 | 有效移除椒鹽式雜訊（Salt-and-pepper noise）等孤立的極端值像素。 |
| 適用情境 | 需要在不影響主要物件形狀的前提下，精確移除特定尺寸的雜訊或小物件。 | 快速去除隨機的亮暗點雜訊，且對邊緣的模糊效應比均值濾波小。 |
| 缺點 | 計算量較大，過程較複雜。 | 對於大片叢集的雜訊效果有限，且可能模糊細微的紋理。 |
以下 Macro 腳本將演示如何使用形態學重建來移除 Dot Blot 範例影像中的亮點與暗點，並與中值濾波器 (Median Filter) 的結果進行比較。
run("Dot Blot");
run("Invert");
run("Duplicate...", "title=origin");
/*
* 去除亮點
* 對原始灰階影像進行一次腐蝕（Erosion）。腐蝕會將所有小的山峰消除或變淺，形成一個平滑的底圖。這個平滑後的影像就是你的標記影像。
*/
selectImage("origin");
run("Morphological Filters", "operation=Erosion element=Square radius=2");
rename("erosion-marker");
/*
* 執行膨脹式重建 (reconstructByDilation)，將腐蝕後的標記影像在原始影像的約束下進行膨脹。這個過程會把標記影像「膨脹」回原始影像的形狀，但那些在腐蝕階段被移除的亮點將無法恢復。
*/
run("Morphological Reconstruction", "marker=erosion-marker mask=origin type=[By Dilation] connectivity=8");
rename("deLightResult");
/*
* 移除暗點（Pepper Noise）
* 暗點在灰階影像的地形圖中代表微小的「山谷」。膨脹式重建的「注水」原理正好可以用來填平這些小山谷。
* 對原始灰階影像進行一次膨脹（Dilation）。膨脹會有效地小的「山峰」（包括亮點）擴大或與其他山峰合併，暗點填平，形成一個平滑的頂圖。這個平滑後的影像就是你的標記影像。
*/
selectImage("origin");
run("Morphological Filters", "operation=Dilation element=Square radius=2");
rename("dilation-marker");
/*
* 執行腐蝕式重建 (reconstructByErosion)，將膨脹後的標記影像在原始影像的約束下進行腐蝕。這個過程會把標記影像「腐蝕」回原始影像的形狀，但那些在膨脹階段被移除的亮點將無法恢復。
*/
run("Morphological Reconstruction", "marker=dilation-marker mask=origin type=[By Erosion] connectivity=8");
rename("deDarkResult");
/*
* 結合以上兩者操作，進行連續操作
*
*/
selectImage("origin");
run("Morphological Filters", "operation=Erosion element=Square radius=2");
rename("erosion-marker");
run("Morphological Reconstruction", "marker=erosion-marker mask=origin type=[By Dilation] connectivity=8");
rename("deLightResult");
selectImage("deLightResult");
run("Morphological Filters", "operation=Dilation element=Square radius=2");
rename("dilation-marker");
run("Morphological Reconstruction", "marker=dilation-marker mask=deLightResult type=[By Erosion] connectivity=8");
rename("result");
// 新增中值濾波器做比較
selectImage("origin");
run("Duplicate...", "title=median-result");
run("Median...", "radius=2");
// 觀察原始影像和兩種處理後影像的差異
imageCalculator("Subtract create 32-bit", "origin","result");
selectImage("Result of origin");
rename("Diff-Reconstruction");
setMinAndMax(-100, 100);
run("3-3-2 RGB");
imageCalculator("Subtract create 32-bit", "origin","median-result");
selectImage("Result of origin");
rename("Diff-Median");
setMinAndMax(-100, 100);
run("3-3-2 RGB");
run("Tile");
分析需求
圖為血管內皮細胞在Matrigel內形成了微血管網絡，需要分析
1. 血管環數量(中間有一個洞，周圍一圈，就可以稱做一個環)
2. 微血管總長度 (微血管形成的網路所有length的總和)
3. 微血管平均管徑
請參考教學影片，逐步執行Macro觀察
// 先開啟檔案
run("8-bit");
rename("origin");
// 裁切
makeRectangle(0, 0, 864, 668);
run("Crop");
// 降噪
selectImage("origin");
run("Duplicate...", "title=deNoise ");
run("Gaussian Blur...", "sigma=2");
run("Median...","radius=3");
// 局部對比度增強 CLAHE
selectImage("deNoise");
run("Duplicate...", "title=CLAHE ");
run("Enhance Local Contrast (CLAHE)", "blocksize=63 histogram=256 maximum=3 mask=*None*");
// MorphologicalSegmentaion
selectImage("deNoise");
run("Duplicate...", "title=deNoiseInverse");
run("Invert");
run("Morphological Segmentation");
// 局部threshold
selectImage("CLAHE");
run("Duplicate...", "title=localThreshold");
run("Auto Local Threshold", "method=Niblack radius=15 parameter_1=0 parameter_2=0 white");
// 形態學處理
selectImage("localThreshold");
run("Duplicate...", "title=fillHoles");
run("Fill Holes");
// 產生distance map
selectImage("fillHoles");
run("Duplicate...", "title=Distance");
run("Distance Map");
// 產生Maxima當種子
selectImage("Distance");
run("Find Maxima...", "prominence=10 exclude output=[Point Selection]");
roiManager("Add");
// 血管寬度與長度估算
selectImage("deNoise");
run("Duplicate...", "title=ridge ");
run("Ridge Detection", "line_width=10 high_contrast=150 low_contrast=20 darkline estimate_width extend_line displayresults add_to_manager method_for_overlap_resolution=SLOPE sigma=3.39 lower_threshold=0.51 upper_threshold=1.36 minimum_line_length=0 maximum=0");
/*
// 產生梯度圖
selectImage("deNoise");
run("Duplicate...", "title=edge");
run("Find Edges");
*/
/*
// 降噪更多產生distance map
selectImage("origin");
run("Duplicate...", "title=deNoiseMoreInvert ");
run("Gaussian Blur...", "sigma=2");
run("Median...","radius=2");
run("Auto Local Threshold", "method=Niblack radius=15 parameter_1=0 parameter_2=0 white");
run("Fill Holes");
run("Distance Map");
run("Invert");
run("Enhance Contrast", "saturated=0.35");
*/
Frangi Vesselness filter 是一種專門用來偵測影像中血管狀、管狀（tubular structures）結構的影像處理演算法，主要根據局部灰階變化的「二階導數資訊」來判斷結構是否像「管子」。
想像你用手在圖片表面摸，這個方法會幫你感受到圖片上哪裡是「凹進去」、「凸出來」或「平平的」。 Hessian 矩陣分析影像每個像素點的彎曲程度和方向，特別是找出線條、溝槽、彎曲的地方。
Frangi Vesselness filter 會觀察這些彎曲程度的數字（稱為「特徵值」（eigenvalue）），並依據這些數字來判斷某個區域像不像血管。
以2D圖片來說，管狀物的特徵是一個方向平、另一方向凹得很深，這種特徵就會在Frangi中被強調出來，分數越高越可能是血管
scale：指的是 Frangi filter 中的σ 值，控制血管偵測的「粗細尺度」。
執行Process › Filters › Frangi Vesselness之後，將stack做Image › Stacks › Z Project...，在此前後應該進行各種前處理，例如：
得到的成果再做骨架化處理，執行Plugins › Skeleton › Skeletonize (2D/3D)與分析骨架顯示結果，執行 Analyze › Skeleton › Analyze Skeleton (2D/3D)，勾選Show detailed info。
File › Open Samples › Bat Cochlea Volume蝙蝠耳蝸當成範例，這是一個已經二值化的影像。Image › Stacks › 3D Project...或是 Plugins › 3D Viewer 觀察其立體結構。Plugins › Skeleton › Skeletonize (2D/3D)Analyze › Skeleton › Analyze Skeleton (2D/3D)，勾選Show detailed infoPlugins › Skeleton › Skeletonize (2D/3D)Analyze › Skeleton › Analyze Skeleton (2D/3D)，勾選Show detailed info// ==== 使用者可調參數 ====
totalTargetLength = 300; // 目標總長度（像素）
maxDepth = 8; // 分支深度（越大分支越多）
angleVariation = 80; // 分支角度變化範圍（度）
branchRatio = 0.7; // 分支長度縮短比例
// ==== 隨機控制開關 ====
enableRandomness = false; // 全域隨機控制開關
enableRandomAngle = false; // 啟用隨機角度？
enableRandomLength = true; // 啟用隨機長度？
// ==== 畫樹狀分支函數 ====
function drawBranch(x, y, angleDeg, length, depth) {
if (depth == 0) return 0;
if (totalDrawnLength + length > totalTargetLength)
length = totalTargetLength - totalDrawnLength;
if (length <= 0) return 0;
angleRad = angleDeg * PI / 180;
// 計算終點
x2 = x + cos(angleRad) * length;
y2 = y + sin(angleRad) * length;
// 分支寬度隨深度調整
maxRadius = 8;
baseRadius = maxRadius * (depth / maxDepth);
radius = baseRadius;
if (enableRandomness && enableRandomLength)
radius *= 0.8 + 0.4 * random(); // 半徑加入隨機變異
if (radius < 1) radius = 1;
// 繪製分支：使用小圓點堆疊形成粗線
steps = floor(length);
for (i = 0; i <= steps; i++) {
px = x + cos(angleRad) * i ;
py = y + sin(angleRad) * i ;
makeOval(px - radius / 2, py - radius / 2, radius, radius);
run("Fill");
}
totalDrawnLength += length;
// 新分支長度與角度變化
newLength = length * branchRatio;
if (enableRandomness && enableRandomLength)
newLength *= 0.8 + 0.4 * random();
delta = angleVariation;
if (enableRandomness && enableRandomAngle)
delta *= (random() * 2 - 1); // 在 ±angleVariation 範圍內隨機
// 遞迴分支（左右）
currentBranchLength = 0;
if (!enableRandomness || random() < 0.8)
currentBranchLength = currentBranchLength + drawBranch(x2, y2, angleDeg - delta, newLength, depth - 1);
if (!enableRandomness || random() < 0.8)
currentBranchLength = currentBranchLength + drawBranch(x2, y2, angleDeg + delta, newLength, depth - 1);
return length + currentBranchLength;
}
// ==== 建立畫布 ====
width = 512;
height = 512;
newImage("Vessel Tree", "RGB black", width, height, 1);
setColor(255, 255, 255);
run("Line Width...", "line=3");
// ==== 全域變數 ====
totalDrawnLength = 0;
// ==== 主程式 ====
setBatchMode("hide");
setBatchMode(true);
startX = width / 2;
startY = height - 10;
initialLength = totalTargetLength / 3.0;
print("開始繪製樹狀血管樹...");
totalDrawnLength = drawBranch(startX, startY, -90, initialLength, maxDepth);
setBatchMode(false);
print("估計總長度（程式計算）: " + totalDrawnLength);
//run("8-bit"); // 確保影像為8位元格式
//run("Skeletonize (2D/3D)"); // 對血管輪廓進行骨架化處理
//run("Analyze Skeleton (2D/3D)", "prune=none show display"); // 分析骨架並顯示結果，包括總長度
形態學運算主要應用於二值影像，用來分析與處理影像中物件的形狀、結構與分布。相關功能集中於 Process > Binary > ...子選單中。
Make Binary 建立二值圖：
將影像轉換成黑白（0/255）圖像。預設會根據選取區域或整張影像的直方圖，自動決定閾值。若已設定閾值（Image > Adjust > Threshold），將會跳出對話框詢問設定前景/背景顏色，以及是否反轉黑白。
Convert to Mask 轉為遮罩：
根據目前的閾值設定將影像轉成二值圖。若未設定閾值，則會自動計算。預設輸出為「反轉 LUT」（白為 0、黑為 255），除非在 Process > Binary > Options 中勾選了 Black Background。
Erode 侵蝕：
從黑色物件邊緣移除像素，相當於縮小物件。可用來去除尖角、毛刺或細小突出。對灰階影像可使用 Process > Filters > Minimum 模擬。
Dilate 膨脹：
向黑色物件邊緣加入像素，相當於擴大物件。可填補小孔或斷裂。對灰階影像可使用 Process > Filters > Maximum 模擬。
Open 開啟： 先侵蝕再膨脹。可移除小雜訊、斷開細連線。適合清除背景雜點而不影響主體。
Close 關閉： 先膨脹再侵蝕。可填補小孔洞、連接相近物體。適合使主體更為連貫。
Skeletonize 骨架化： 持續移除物體邊緣像素，直到只剩單像素寬的骨架。用於分析結構拓撲（如細胞通路）。
Outline 描邊： 對物件產生單像素寬邊框。可視為邊緣檢測的一種形式。
Distance Map 距離變換： 計算每個前景像素與最近背景像素的歐式距離，結果為灰階圖，產生Euclidian distance map (EDM)。適合用於分析粒子間距或後續分割。
Ultimate Points 終極點： 對距離圖找出每個粒子內最大內切圓的中心，灰階值代表半徑。可作為分割粒子依據。產生ultimate eroded points (UEPs)。
Watershed 分水嶺分割： 自動分離接觸或重疊的粒子。流程包含建立距離圖、找終極點，然後從終極點開始膨脹直到互相接觸為止。適用於圓形、不重疊太多的粒子分離。
Voronoi 沃羅諾伊分割： 依據與最近兩個粒子的邊界距離，為每個粒子建立一個區域。適合做為粒子領域劃分（Voronoi tessellation）。
透過 Process > Binary > Options... 可調整以下參數：
Iterations（次數）： 設定侵蝕、膨脹、開啟、關閉等操作的重複次數。
Count（鄰近像素數）： 決定侵蝕/膨脹時像素被加入/移除所需的鄰近像素數。
Black Background： 勾選此選項代表背景為黑，物件為白。這會影響大多數形態操作與距離圖的計算。
可用下列方式設定：
// Plugin
Prefs.blackBackground = true;
// Macro
setOption("black background", true);
Pad Edges when Eroding： 勾選時，侵蝕操作不會作用於影像邊緣（避免邊界損失）。
EDM Output（距離圖輸出格式）： 設定 Distance Map、Ultimate Points、Voronoi 等輸出的格式：
"Overwrite"：覆蓋原圖（8-bit）
"8-bit" / "16-bit" / "32-bit"：輸出為新的影像，32-bit 為 subpixel 精度。
執行以下Macro，進行各種二值化操作，觀察圖形的變化
// 建立空白影像
newImage("BinaryDemo", "8-bit black", 512, 512, 1);
setForegroundColor(255, 255, 255);
// ---------- 粗圓 + 毛刺 ----------
for (i = 0; i < 3; i++) {
x = 80 + i * 60;
y = 80;
r = 25;
makeOval(x - r, y - r, r * 2, r * 2);
fill();
}
// 毛刺圓形
centerX = 250;
centerY = 80;
nPoints = 36;
xPoints = newArray(nPoints);
yPoints = newArray(nPoints);
for (i = 0; i < nPoints; i++) {
angle = 2 * PI * i / nPoints;
r = 25 + random() * 10;
xPoints[i] = centerX + r * cos(angle);
yPoints[i] = centerY + r * sin(angle);
}
makeSelection("polygon", xPoints, yPoints); fill();
// ---------- 細線 ----------
for (i = 0; i < 4; i++) {
y = 150 + i * 10;
makeLine(50, y, 200, y);
run("Draw", "slice");
}
// ---------- 貼邊形狀 ----------
makeRectangle(0, 300, 60, 60); fill();
makeRectangle(450, 300, 60, 60); fill();
makeRectangle(200, 450, 100, 60); fill();
// ---------- 破碎物件 ----------
setColor(255, 255, 255);
makeRectangle(300, 300, 20, 20); fill();
makeRectangle(321, 300, 20, 20); fill();
makeRectangle(342, 300, 20, 20); fill();
makeRectangle(321, 321, 20, 20); fill();
// ---------- 密集群圓 ----------
x0 = 400;
y0 = 400;
r = 15;
for (i = 0; i < 3; i++) {
for (j = 0; j < 3; j++) {
dx = x0 + i * 25;
dy = y0 + j * 25;
makeOval(dx - r, dy - r, r * 2, r * 2);
fill();
}
}
// 二值化
run("Make Binary");
執行以下macro，產生三張圖片，模擬不同的粒子分佈，試試看執行Voronoi分隔。
// 參數設定
width = 512;
height = 512;
pointRadius = 3;
// 建立空白影像
newImage("Multi-Pattern Particles", "8-bit black", width, height, 1);
setForegroundColor(255, 255, 255);
// -------------------- 區域1：隨機分佈 --------------------
nRandom = 50;
for (i = 0; i < nRandom; i++) {
x = random()*160 + 10; // 區域X: [10,170]
y = random()*160 + 10; // 區域Y: [10,170]
makeOval(x - pointRadius, y - pointRadius, pointRadius*2, pointRadius*2);
fill();
}
// -------------------- 區域2：密集群聚 --------------------
nClusters = 3;
pointsPerCluster = 20;
for (c = 0; c < nClusters; c++) {
cx = 200 + c * 30 + random()*10; // 區域X: 約在 200-300
cy = 60 + random()*60;
for (i = 0; i < pointsPerCluster; i++) {
dx = random()*20 - 10;
dy = random()*20 - 10;
x = cx + dx;
y = cy + dy;
makeOval(x - pointRadius, y - pointRadius, pointRadius*2, pointRadius*2);
fill();
}
}
// -------------------- 區域3：規則排列 --------------------
for (i = 0; i < 6; i++) {
for (j = 0; j < 6; j++) {
x = 350 + i * 20;
y = 50 + j * 20;
makeOval(x - pointRadius, y - pointRadius, pointRadius*2, pointRadius*2);
fill();
}
}
// 完成後進行二值化
run("Make Binary");
Top-hat 濾波是一種基於形態學開運算的背景校正與特徵增強方法，方法是：原圖 - 開運算結果，突顯比結構元素小的亮特徵（常用）。
Process > Filters > Top Hat...結構元素半徑建議大於目標特徵，且小於背景變化尺度。
Macro 範例
run("Blobs (25K)");
run("Invert LUT");
run("Duplicate...", "title=topHat50");
run("Top Hat...", "radius=50");
一種用來偵測亮點（spot）的常見方法，特別是在影像中物體呈現為圓形、亮、背景暗的情況下非常有效。
DoG 是「Difference of Gaussian」的縮寫，即高斯差分，是用來近似 Laplacian of Gaussian的一種方法，但比 LoG 更快、計算上更省資源。
設定一個預期粒子直徑 d，根據圖像中粒子的外觀（例如細胞、點狀物）的大小手動設定。
計算兩個不同模糊程度的高斯標準差，使用下面的公式計算兩個高斯模糊的 σ（標準差）：這兩個 sigma 對應到不同的模糊程度：σ₁ 比較小，保留細節；σ₂ 比較大，模糊程度高。
尋找局部極大值（Local Maxima）對 DoG 圖像進行極大值搜尋，這些就是候選亮點。每個亮點會被指派一個「品質指標（quality）」，即 DoG 值的強度。
距離過近者去除，如果兩個亮點的距離小於 𝑑/2，則刪除品質較差的那一個。
進行次像素定位（Sub-pixel localization）使用拋物線內插法（parabolic interpolation），讓亮點的位置更精確。
// ==== 使用者設定參數 ====
// 預期的粒子直徑 (像素)，這個值會用來推算兩個 Gaussian 模糊的程度
particle_diameter = 40;
// 設定 Find Maxima 的強度閾值，過濾掉太弱的亮點
quality_threshold = 10;
// ==== 推導參數 ====
// sigma1 與 sigma2 是 DoG (Difference of Gaussians) 所需的兩個不同 sigma
sigma1 = particle_diameter / (1 + sqrt(2));
sigma2 = sqrt(2) * sigma1;
// ==== 建立測試影像與反相處理 ====
// 產生 ImageJ 內建的 dot test image
run("Dot Blot");
// 將影像反相，讓亮點變成白點（方便找 maxima）
run("Invert");
// ==== 複製原始影像供後續處理 ====
// 備份目前影像為 "Original"
run("Duplicate...", "title=Original");
rename("Original");
// ==== 對影像做第一次 Gaussian 模糊（sigma1）====
run("Duplicate...", "title=Blur1");
run("Gaussian Blur...", "sigma=" + sigma1);
// ==== 對影像做第二次 Gaussian 模糊（sigma2）====
// 從原始影像再複製一次為 "Blur2"
selectWindow("Original");
run("Duplicate...", "title=Blur2");
run("Gaussian Blur...", "sigma=" + sigma2);
// ==== 兩張模糊影像相減，產生 DoG ====
// 計算 Blur1 - Blur2，將結果命名為 DoG
imageCalculator("Subtract create", "Blur1", "Blur2");
rename("DoG");
// ==== 找出 DoG 圖中的亮點中心 ====
// 使用 Find Maxima 找出顯著的亮點位置
run("Find Maxima...", "prominence="+ quality_threshold +" output=[Point Selection]");
// ==== ROI manager ====
// 清空 ROI manager
roiManager("Reset");
// 把目前偵測到的亮點選區加到 ROI manager
roiManager("Add");
// ==== 在原始影像中顯示這些點選區 ====
// 切換回 "Original" 視窗
selectWindow("Original");
// 選擇剛剛儲存到 ROI manager
roiManager("Select", 0);
// ==== 清理中間影像====
// 關閉中介處理影像視窗
selectWindow("Blur1"); close();
selectWindow("Blur2"); close();
selectWindow("DoG"); close();