2012年9月8日

用顯微測微尺搭配imagej應用來計算顯微影像的長度

今年我在讓學生畫顯微鏡下的圖片時,都特別要他們依照視野中的比例來繪圖,我的目的之一就是要讓他們事後可以依照自己的圖片來估算出細胞的大小。

怎麼估呢?就如同上次寫了關於成像圈的一些注意事項《簡易顯微測量-成像圈很重要》,只要用一把尺,拍下它在顯微鏡下的影像就可以,而且因為倍率的變化都是固定的,物鏡從4x 到10x到40x,所以其實只要拍下在4x物鏡下的影像就可以,剩下的可以用估算。

不過我上次拍了自家顯微鏡的影像之後,我還是很好奇,用隨便一把尺和用顯微測微尺來看,誤差到底有多少。我們家的顯微鏡倍率分別是40x、100x、400x,上次測量的結果,視野直徑依序為4200µm、1680µm、420µm,這次我特別拿了玻片的測微尺來測量,看看結果會如何?

顯微鏡的測微方式,通常有兩個部份,一個是特製玻片,上頭有很小很小的刻度,以我手邊的這種來說,它是1mm的長度中,刻劃了100個刻度,所以每個刻度之間的距離是 0.01mm,也就是10µm。通常搭配使用的還有一小片玻璃片,上頭也有刻度,那是裝在目鏡裡用的。使用時,用已知長度的測微玻片來校正目鏡的刻度,舉例來說,像下面這張圖,是我用10倍目鏡10倍物鏡下拍攝的,我的目鏡測微尺的刻度,剛好和玻片上的刻度吻合,在這個倍率下,我的每個小刻度就等於10µm,日後我就可以用這個目鏡測微尺來量度顯微鏡下物體的長度。



然而不同的倍率下,目鏡測微尺的刻度不像這次這麼吻合,像我在40倍的倍率下,40格的目鏡測微尺長度等於1 mm(1000µm),所以我40倍的刻度是每格代表25µm,而400倍下則是每格代表2.5µm。

雖然這種測量方式還不錯,但是若要改成用電腦來協助測量,那作法就稍有改變了,我們不需要目鏡裡的那個測微尺。我們只要把測微玻片放在載物台上,每個倍率拍一張照片,特別注意要把視野全部都拍攝近來。

這個是我家顯微鏡的40x


這是100x


這則是400x



既然我們已經知道每個刻度都是10µm,那麼我們就可以用imagej估計出整個視野的長度了。我測量出來的結果,和先前用那個普通尺的結果誤差不大。我的三個倍率下(40x、100x、400x)
視野長度分別為4617 µm、1830µm和452µm。

所以未來我用這台顯微鏡進行顯微攝影時,只要知道是用哪個倍率,而且有拍攝到成像圈(不需要全部完整,但至少要能抓出直徑),那麼我就可以改用成像圈來當比例尺,藉而估算細胞的大小了。


我做完這個之後,突然有個小問題,如果兩台顯微鏡的型號不同,但倍率都相同,那麼視野的寬度是否都相同呢?後來我拿了學校的顯微鏡,兩台都是15倍目鏡,總放大倍率依序為60x、150x、600x,結果發現兩者的視野寬度還是略有不同。

以這種反光鏡式的顯微鏡,60x 下是2422 µm,150x是 934 µm,而600x 是234 µm。若是把目鏡換成WF(wide field)的,雖然是同樣倍率,但視野寬度也不同。所以若要用顯微鏡的成像圈當作測量的比例尺,還是要每個顯微鏡各自建檔。



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我有個想法,學生把細胞都畫完以後,我打算要他們把所有的細胞,畫在同樣的比例尺上,藉以比較各種不同細胞的大小。會想到這點是因為連我自己都很難想像,同樣是人類的細胞,彼此的大小就差非常多。

比方說口腔皮膜細胞和紅血球細胞,我在沒作這種比例尺比較之前,我從沒想過紅血球居然只有口腔皮膜細胞的細胞核大而已(下圖中左右的比例尺皆同)。
皮和血的比較2
上面這張圖的作法,我是先用Gimp開啟有400x 成像圈的口腔皮膜,然後把紅血球的影像(也有成像圈)放在同一張,先把兩者的成像圈調成一樣大,因為拍照時能會拍得不一樣,然後我再用imagej開啟,先用已知成像圈的大小(400x下 452µm)來 set scale,然後再用Analyze >Tools>Scale Bar..,來設定比例尺。

課程設計安排的部份,像今年我教資優班,有多一些上課時間,所以我就可以在另外的專研課教imagej,教怎麼用電腦來設定比例尺計算長度,而教普通班時,因為時間沒那麼多,所以就會直接教長度換算,例如告訴他們現在用的顯微鏡某某倍率下,視野寬度有多長,請他們試試看估算細胞的長度。



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