以Imagej合成全對焦影像

使用顯微鏡拍照時,有一個難以克服的問題就是淺景深,整個畫面中無法讓前到後都清楚。
想像一個細胞是一棟透天厝,顯微攝影是從高空往下拍,因為淺景深,所以往往是三樓清楚、而一二樓模糊,或者是二樓清楚、一三樓模糊。

景深和數值孔徑的關係密切,計算公式可以從這篇論文(以全對焦影像合成技術修正失焦顯微鏡影像
)找到。

數值孔徑越小,放大倍率較大,景深數值較深
以10倍物鏡來說,數值孔徑是0.25,景深是8.5um
換到40倍物鏡,數值孔徑是0.65,景深只剩下1um

克服景深的問題,在軟體方面,有很多專業的顯微量測影像處理軟體都可以處理,不過那些是收費軟體。屬於開放原始碼的ImageJ當然也有這樣的能力來處理。

處理的流程如下
  1. 攝影
  2. 安裝ImageJ的Plugin
  3. 使用Plugin做影像對齊校正
  4. 使用Plugin做全對焦合成
攝影的部份,我先以數位相機拍攝書本的例子來說明。

下方的四張圖拍攝位置都不變,但改變的是對焦的地方,因為使用微距攝影,所以景深淺,每張照片都只有一部分是清楚的。拍攝時要注意相機位置、構圖不可改變,另外曝光量也不可以改變,數位相機有AE Lock的功能可以鎖定曝光值(我在拍攝這四張樣本的時候,忘記鎖曝光值,所以看起來曝光不一樣)



再來是安裝Plugins,這裡需要三個Plugins,分別是TurboRegStackRegStack Focuser
前面二個是作影像自動對齊的,雖然我們固定了相機位置和構圖,但是實際拍攝的相片還是會有些微的差距,所以需要另外做自動對齊。
而最後一個Plugins是用來做產生合成圖的。

TurboRegStackReg下載以後解壓縮直接放在plugins的資料夾即可,Stack Focuser 可以放在plugins的Stacks資料夾中。

首先開啟拍攝的四張不同焦點的照片
File-->Open

將多個影像合成一個Stack
Images-->Stacks-->Convert Images to Stack

使用stackreg自動對齊影像
Plugins-->stackreg-->Stackreg


使用Stack Focuser合成為全對焦的影像
Plugins-->Stacks-->Stack Focuser

結果如下,看起來有點醜喔?那是因為我失焦的地方太模糊了,所以才會變成這樣,再加上我一開始拍攝的時候沒有鎖定曝光值。



接下來以顯微照片實際示範,以下是拍攝彩葉草葉脈處的導管(像彈簧的東西),三張的焦點都不同。我也沒有事先做白平衡,打算最後再用影像處理軟體處理。


然後我把三張合成為一個Stack之後,用Stackreg作自動對齊,順便做剪裁,只留下中間我需要的部位。影像如果太大,那些Plugin處理會弄很久。


最後用Stack Focuser生出的影像,原本失焦的地方不再模糊。



最後用Gimp開啟影像作自動白平衡
圖層-->色彩-->白動-->白平衡



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