以imagej的macro實作GUI，進行重疊細胞的分割

上週五收到一個生技公司人員的來信，信中問到要作細胞的分割來計數，但是作分水嶺分割時出現問題。我寫imagej作細胞分割的文章其實寫了好幾篇，本來想說請他看看之前文章就好。不過因為給的圖片很漂亮，剛好議題又是我感興趣的，所以就試試看來解決了。

來看一下圖片。這是利用不同劑量的藥劑處理非癌化細胞後，再以螢光染劑進行染色。研究者的目的是要計算這有多少細胞。


由於有些細胞是重疊的，一般想法就是直接作分水嶺切割，然後再作analyze particles。不過這樣的作法會有大問題。


這是我們期待看到的，兩個細胞被分水嶺算法剛好切開。



但實際上會發生的是，單獨一個細胞往往會被切成好幾塊



或是兩個細胞被切成三塊

如何解決這樣的問題呢？

解決流程是這樣的

(1)先把單獨未重疊的單顆細胞抓出，並計數。

(2)只針對重疊的細胞作分水嶺切割，然後作計數。

現在問題來了，怎麼知道誰是單顆細胞，這裡會運用一個形態學的運算方式來幫助判斷。
以下兩張圖是先將圖片做threshold處理後，轉二值化影像，再用wand tool選取後，然後用Edit/Selection/Convex hull做出的新選取區。

convex hull是個重點！它就像是用條橡皮筋套住你的選取區，產生的新選取區就是convex hull。你看第一張圖片，是兩個細胞重疊，用convex圈起之後，會留下很多沒圈到的地方。第二張圖片是單獨的細胞，圈起來之後留下的空白很少。

所以啊，我們可以用convex hull和細胞的面積做運算，看看細胞在hull裡頭佔面積的多寡來推論那是不是單獨的細胞。

要計算這個東西，其實不用自己手動一個一個圈細胞。在measure中的測量值solidity就是這個啦。你可以勾選Analyze/Set Measurements/Shape descriptors，就可以呈現出這個數值了。

接下來的分析和製作Macro，我就交給影片說明了

影片中所使用的Macro 就是以下的文字啦

=============================================
Dialog.create("Preference");
Dialog.addNumber("solidity:", 0.88);
Dialog.addNumber("cell area min :", 2000);
Dialog.addCheckbox("Single cell fill color", true);
Dialog.addCheckbox("Watershed cell fill color", true);
Dialog.show();
solidityValue = Dialog.getNumber();
cellAreaMin = Dialog.getNumber();
singleCheck = Dialog.getCheckbox();
watershedCheck = Dialog.getCheckbox();

//關閉所有圖檔
run("Close All");
//製作結果表
Table.create("cellCounts");

//打開資料夾，取得檔案list
dir = getDirectory("Choose a Directory ");
list = getFileList(dir);
filecount = 1;
listFiles(dir);

function listFiles(dir) {

for (i=0; i<list.length; i++) {
if (endsWith(list[i], "/")){}

// listFiles(""+dir+list[i]);
else{
//print((filecount++) + ": " + dir + list[i]);
open(dir + list[i] );
bname=File.nameWithoutExtension;
cellCounts();
}
}
}

function cellCounts(){
//細胞有幾個
cellNum_single=0;     //一個單獨的細胞
cellNum_overlap=0;     //重疊的細胞團
  cellNum_watershed=0;  //分水嶺切割後，單獨的細胞

rename("original");

//製作空白的檔案
run("Duplicate...", "title=cell_single");
run("Select All");
setBackgroundColor(255, 255, 255);
run("Clear", "slice");
run("Duplicate...", "title=cell_overlap");
run("Duplicate...", "title=cell_watershed");

//分析前處理
selectWindow("original");
run("Duplicate...", "title=a");
run("8-bit");
setAutoThreshold("Default dark");
run("Convert to Mask");

//把所有細胞都抓出，設定measure參數
run("Set Measurements...", "area perimeter shape redirect=None decimal=3");
run("Analyze Particles...", "size="+cellAreaMin+"-Infinity circularity=0.10-1.00 display exclude clear include add");

//用Solidity推斷細胞是否有重疊
numROIs = roiManager("count");
for(i=0; i<numROIs;i++) {// loop through ROIs
solidity = getResult("Solidity", i);

if(solidity>solidityValue){//Solidity大於0.88者，應該是單顆細胞
cellNum_single =cellNum_single +1;
//塗色
if (singleCheck){
selectWindow("cell_single");
roiManager("Select", i);
setForegroundColor(255*random, 255*random,255*random); //隨機填入顏色
run("Fill");
}
}

else {//如果是小於0.88，可能是多個細胞重疊，進入迴圈作分水嶺切割
cellNum_overlap =cellNum_overlap +1;
selectWindow("cell_overlap");
roiManager("Select", i);
setForegroundColor(0,0,0); //填入黑色
run("Fill");

}
}

//到cell_overlap的圖片中，執行分水嶺算法
selectWindow("cell_overlap");
run("Make Binary");
run("Watershed");
run("Select All");
run("Analyze Particles...", "size="+cellAreaMin+"-Infinity circularity=0.10-1.00 display exclude clear include add");
numROIs = roiManager("count");
for(i=0; i<numROIs;i++) {// loop through ROIs
cellNum_watershed =cellNum_watershed +1;
if(watershedCheck){
selectWindow("cell_watershed");
roiManager("Select", i);
setForegroundColor(255*random, 255*random,255*random); //隨機填入顏色
run("Fill");
}
}

//輸出細胞的計數結果
rowsize = Table.size("cellCounts");
Table.set("filename", rowsize, bname,"cellCounts");
Table.set("cell_single",rowsize, cellNum_single,"cellCounts");
Table.set("cell_overlap",rowsize, cellNum_overlap,"cellCounts");
Table.set("cell_watershed",rowsize, cellNum_watershed,"cellCounts");
Table.update("cellCounts");

//關閉圖檔
selectWindow("cell_single");
saveAs("Jpeg", dir+"1/" + bname+"_1_single"+".Jpg");
selectWindow("cell_overlap");
saveAs("Jpeg", dir+"1/" + bname+"_2_overlap"+".Jpg");
selectWindow("cell_watershed");
saveAs("Jpeg", dir+"1/" + bname+"_3_watershed"+".Jpg");


close("cell_single");
close("cell_overlap");
close("cell_watershed");
close("a");
close("original");
close("Results");
close("ROI Manager");
}

以Onshape製作有卡榫的雷切盒子

像下圖這種有螺絲卡榫T slot的壓克力盒子，在網路上可以找到一些製作程式，例如inkscape的外掛，Google相關的關鍵字可以找到一些。

不過用2D的軟體製作時，遇到一些要微調或組合調整的時機時，有時候會難以想像，所以若是能以3D建模軟體製作，應該能夠省事一些。

目前線上3D軟體很多，這篇介紹的Onshape只是其中之一，功能強大值得學習。只要用瀏覽器就可以執行，不需要另外安裝更新軟體，檔案也都是雲端儲存。目前有教育版可以使用，只要簡單註冊程序即可。

製作的成品如下



組合出來的樣子會是這樣





軟體可以產生供雷切機使用的dxf檔案


可以製作爆炸圖，看各個零件的關係





如何入門這套軟體？Onshape的Learning Center有一系列的教學課程，我推薦跟著其中的Learning Pathways學習，可以順利跨過入門階段，能夠恣意利用軟體製作想做的模型。

以下這個播放清單是我製作雷切盒子的教學影片，如果你有興趣以Onshape製作類似的模型，也可以參考這個影片來學習製作。影片總長1小時30分。

關於寄生

因為昨天可能吃到了很多海獸胃線蟲，結果晚上做夢就夢到了很多蟲，最特別的是夢到我抓到了一隻巨大熊蟲﹑足足三公分大啊。要知道如果用肉眼看熊蟲，充其量就是個小點點而已，我可是夢到了一隻巨無霸啊。


既然講到寄生，就來寫本書的紀錄，「繪圖解說-寄生蟲的世界」，是去年出版的，作者是長谷川英男，日本的寄生蟲學者。

書裡一單元提到何謂寄生，作者提了幾個有趣的知識，生物的交互關係其實是會在不同情況下改變的。

就以小丑魚和海葵兩者來說，小丑魚會住在海葵的觸手之間，因為其他魚類會被小丑魚觸手的刺絲胞傷害，所以不會靠近海葵。但是小丑魚體表會分泌不會刺激刺絲胞的黏液，所以牠就可以安然無事躲在觸手之間。就海葵的角度來說，小丑魚算是片利共生的傢伙，因為自己不會得到好處。

但是當小丑魚會來驅趕其他吃海葵觸手的魚類，或是清除海葵觸手之間的垃圾時，這時關係又變成了互利共生。然而小丑魚有時也會吃掉海葵的觸手，那麼這關係卻又偏向寄生了。

再以鮣魚這種會藉由吸盤吸附在大型魚類身上來移動的魚類來說，這種關係對於大魚來說沒好處也沒壞處，算是片利共生的例子。其實身上黏著一條條魚，行動也很麻煩吧。然而鮣魚有時候又會吃掉在大魚體表的寄生型甲殼類，這樣的關係又會成了互利共生。

再來是螞蟻和蚜蟲這課本常提的互利共生例子，其實蚜蟲如果沒有辦法發揮功能的話，螞蟻也會吃掉牙蟲的。那這樣又成了捕食關係。

而牛和其體內的微生物，那些原生動物、細菌們之間的關係也很複雜，牛吃下的草料是藉由微生物的作用才能消化纖維素讓牛獲得養分，如此的關係成了互利共生。但是微生物在牛反芻後就會被胃液殺死消化，成了牛隻的營養，啊這樣的關係又成了什麼。





書中p.10還有一篇講到有寄生蟲的動物群。其實說寄生「蟲」也不好，因為有些根本不是蟲。

在這圖片中列出了動物的類群，類群上頭的符號黑圈圈或白圈圈代表了此類群有寄生種，即使是脊椎動物也有寄生的物種喔。像是八目鰻、盲鰻會吸附在其他魚體身上吸血或是侵入魚體吃牠們的內臟(就這點看來是捕食囉)。

有種會住在海參腸子裡的潛魚會吃掉海參的生殖腺，讓海參無法生殖

有部分種類的鮟鱇魚，其雄魚會和雌魚的身體融合，寄生在雌魚身上。

杜鵑鳥有產卵在其他鳥類巢中的社會性寄生行為。

圖中的演化樹是參考 佐藤 矩行  発生と進化 (シリーズ進化学 (4)) 単行本 – 2004/6/8

生物遊戲之蝙蝠捉飛蛾

這個活動最早是在一次去新竹自然谷參加攀樹活動時親身玩過的。而最近又在這本《全世界孩子都想上的自然探險課：來自「森林學校」的遊戲教育與成長指南》書裡又看到這個活動。

想起前次段考時，考了一題蝙蝠捉蛾與演化有關係的活動，於是就在下課前十分鐘，讓學生玩玩這個遊戲。

材料很簡單，就一個眼罩和一個空曠的場地。不過我沒有眼罩，所以就用口罩代替了。
一個學生當蝙蝠，戴上眼罩。另一位學生當蛾，可在場地裡自由移動。其他學生擔任樹，必須圍住場地。

活動的原則是蝙蝠發出超音波覓食，當超音波碰到飛蛾時，飛蛾會反射超音波，蝙蝠就會知道前面有飛蛾，可以前去覓食。而蝙蝠也會發射超音波來偵測樹木在哪裡，藉此避開樹木。

不過我們模擬活動是沒有辦法發出超音波的，所以就由蝙蝠小朋友自己選自己要發出什麼聲音，有人選「啊」，有人選「逼」還有人選「亞美蝶」（選這麼長的字很慘，因為要整場一直亞美蝶亞美蝶的叫」

擔任飛蛾的小朋友也是選一個聲音，當蝙蝠朝著你叫的時候，你就要發出那個聲音。其實應該要跟著蝙蝠一樣的聲音才對，不過我就讓他們自己選。想不到要發什麼聲音，那就發「蛾蛾蛾」

當樹的小朋友也很忙，因為當蝙蝠朝著你叫的時候，你要反射回去啊。如果想不到要發什麼聲音，那就發「樹樹樹」。

活動在樹圍起來的場地中進行，飛蛾可以自由飛行，但是不能離開樹的範圍。而樹要保護好蝙蝠，不能讓蝙蝠誤闖到界線外，可能會有危險。蝙蝠必須在時間內快速用「超音波」找到飛蛾抓到牠。

活動就這樣，規則很簡單，但是會玩得很瘋狂。試試看，很有趣的！

生物遊戲之猜猜我是誰

最近在課程中進行一個活動，就名為「猜猜我是誰」吧！

進行方式是這樣的
準備一疊牌，是從病毒到哺乳類，每一種學過的生物。學生群中一人當自願者，到台前抽一張生物牌，而這張牌只有老師和此學生可以看，能夠知道那是什麼生物。而其他人是看不到的。

接下來，其他學生舉手問yes/no的問題，台前學生只能回答yes或no。例如「是生物嗎？」「是內溫動物嗎？」諸如此類的題目。台下學生必須用最少的問題來答出那張牌的生物是什麼，最後答對的人就可以拿到此題的加分。當然用的問題越多，加的分數就越少。

對於提問的學生，這是練習分類的一種好方法，要如何用精確的方式快速分類出生物。而對於回答的學生，他自己要很清楚這些問題的對錯。而老師的角色就是檢查學生是否有回答錯，適時給予協助。

此活動過程，可以視學生程度讓學生拿筆記或課本來提問，或是讓學生空手提問也是一種挑戰。

在幾次活動中，也有些有趣的插曲，例如有些學生在前面縮範圍的題目都是靜靜不說話，但是當答案已經呼之欲出時，就會跑出來撿尾刀，殺個措手不及啊。

我沒有要吃海獸胃線蟲謝謝

大學時有一門課叫做寄生蟲學，修課前學長諄諄教誨，上課前要吃飽，不然上完課就會不敢吃東西。

果然，那門課上完後，我再也沒有吃過白帶魚，也沒有用手直接摸蝸牛，更別說是碰觸鳥大便。不吃白帶魚是因為那時要觀察海獸胃線蟲時，只要去買一條白帶魚幾乎都可以看得到，在魚體內長什麼樣子，Google一下就看得到。

過了幾十年後的今天中午，覓食時想說吃個口味重的，揀了一塊白帶魚來吃，就在快要吃光光的時候，眼睛仔細看了筷下的肉，滿嘴的飯和魚肉一時不知道該吞下去還是吐出來。

雖然知道這些蟲煮熟了也是蛋白質來源，但是看到一群在魚肉上還是抖了兩下。抖了第二下是因為都已經吃到這樣了才發現，那之前吃下的那些哩？我想吃口味重的，但是沒有想要吃口味這麼重的線蟲動物門啊！

後記：臉書上一提，結果好多人都吃過，因為有些人以為是血管就一樣吃下去了。